[发明专利]现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及一种刺参腐皮综合症病原(灿烂弧菌)的LAMP检测方法，尤其是一种操作简便、成本低廉、检测准确，可在现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒。

背景技术：

刺参腐皮综合症为暴发性流行病，其传染率高，死亡率高达90％以上，一直危害着海参养殖。研究表明，灿烂弧菌是刺参腐皮综合症的主要病原，尽早检测出灿烂弧菌是有效防治刺参腐皮综合症的先决条件。目前，对于灿烂弧菌的检测方法有免疫荧光技术(FAT)、酶联免疫吸附(ELISA)、分子检测技术(PCR、RFLP、AFLP、RAPD)等，但大多需要昂贵的仪器设备和试剂，或者需要较长的检测时间和足够数量的病原，因受条件限制而不利于早期检测，也不利于在基层养殖户中开展。LAMP检测方法是一种全新的恒温核酸扩增方法，因不需要昂贵的精密仪器，只在一个管内即可以完成全部检测，具有简便、快速、准确、廉价等优点，现在已有用LAMP法检测水产动物和水产养殖环境中病原菌的报道。首次用LAMP法检测水产动物病原菌是迟钝爱德华氏菌，SAVAN等2004年根据迟钝爱德华氏菌的溶血素基因序列设计4条引物，成功地扩增了迟钝爱德华氏菌的溶血素基因，检测出从日本鳗鲡等4种水产动物和养殖水体中分离的5株迟钝爱德华氏菌。将LAMP法和PCR方法的灵敏性进行比较，结果发现LAMP法对迟钝爱德华氏菌的最低检测极限为10CFU·ml^-1，比PCR法灵敏100倍。但是，检测非迟钝爱德华氏菌病原菌，都没有产生特异性扩增，从而证明LAMP法检测具有很强的特异性。迄今为止，还没有关于将LAMP法应用于检测刺参腐皮综合症病原(灿烂弧菌)的相关报道。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术检测刺参腐皮综合症病原所存在的技术问题，提供一种操作简便、成本低廉、检测准确，可在现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法及试剂盒。

本发明的技术解决方案是：一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a.分别取海参样品0.08～0.12克，置于多个不同编号的样品采集管中，将样品磨碎至浆状；

b.分别蘸取不同编号样品采集管中的浆状海参样品，再置入对应编号且内装膜片的采样管中并将膜片润湿；

c.分别吸取无水乙醇2～3滴滴于不同编号的采样管内及内装有膜片的阳性对照管和内装有膜片的阴性对照管中，搅动各管内膜片30秒；

d.将c步骤所得膜片分别转移到对应编号且内装高纯水的膜片漂洗管内，将膜片漂洗管震荡3～4分钟；

e.将漂洗管内的膜片分别转移到相应编号且内装有TE缓冲液的核酸变性管内，95℃保温4分钟，然后再迅速置于冷水或室温条件下2分钟；

f.再将上述核酸变性管内的膜片转移到相应编号的扩增检测管内，将扩增检测管置于61～63℃保温60分钟；85～90℃条件下保温5分钟，然后迅速将扩增检测管上下反复甩动1分钟；所述扩增检测管内装有扩增反应液，扩增反应液组成成分如下：反应引物VS-F3和VS-B3各0.2μmol/L，VS-FIP和VS-BIP各1.6μmol/L，pH8.8的TrisHCl 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgSO₄6mmol/L，(NH₄)₂SO₄10mmol/L，Triton X-1000.1％，Betaine1.6mol/L，dNTP 1.6mmol/L，8U Bst DNA聚合酶；所述扩增检测管盖内由石蜡和聚乙二醇的混合物将0.1μl核酸染料固定在管盖的上方；编号为阳性对照管的扩增检测管内的扩增反应液中还含有海参腐皮综合症致病病原的核酸DNA质粒标准液(10^-4个拷贝)；所述反应引物的DNA序列如下：

VS-F3：5’-TGGTCCCCCCATATTCAGAC；

VS-B3：5’-AAGTACCCCGAGGAAGAGAA

VS-FIP：5’-GCCCCGTAACCGACACATCATTTTAGGATATCACGTGTCCCGC；

VS-BIP：

5’-GGCACTTTCCAGAGCCTTCGTTTTTAGATTCCGAAAGTAGCGGC；

g.用力向下甩动扩增检测管，目测、对比扩增检测管底部反应液颜色。

一种现场快速检测刺参腐皮综合症病原的方法用试剂盒，其特征在于：

有多个不同编号内装剪裁成小片的FTA卡膜片的采样管；