[发明专利]一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法

摘要

本发明涉及一种甲基化DNA检测方法，步骤包括：步骤1，亚硫酸盐处理DNA样品；步骤2，设计并合成PCR引物；步骤3，以标准非甲基化DNA和标准甲基化DNA作为模板分别进行PCR扩增，并测定解链温度；步骤4，对待测DNA样品进行PCR扩增；步骤5，加热PCR扩增产物至标准非甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度、和标准甲基化DNA相应的PCR产物的解链温度之间；步骤6，进行消化；步骤7，进行二次PCR扩增并进行解链曲线测定，检测是否存在甲基化DNA。该方法在肿瘤早期检测、个性化治疗、病情判断和复发监控等方面有着重要的意义。

主权项

一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法，其特征在于，步骤如下：步骤1，采用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；步骤2，在所要检测的基因序列中，选择含多个CpG位点的一段序列作为目标检测序列，并以所选序列的5’端的一部分作为正向PCR引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向PCR引物；步骤3，以亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶，以荧光染料为指示剂，用所述正向PCR引物和反向PCR引物，在实时定量PCR扩增仪中进行扩增，并分别测定扩增产物的解链温度；步骤4，在与步骤3相同的条件下，用所述PCR引物对待测DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使加热温度处于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度和标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度之间；步骤6，立即将步骤5中的加热产物进行冷却，并用单链DNA特异性DNA内切酶将冷却后的体系进行消化；步骤7，将步骤6所得消化产物作为PCR反应模板，使用所述正向PCR引物和反向PCR引物进行实时定量PCR扩增，并进行解链曲线测定；步骤8，判断是否存在甲基化DNA，判断方法为：如果在待测DNA样品中检测到与标准甲基化DNA相应PCR产物相一致的特征性解链曲线，则待测样品中存在甲基化DNA；反之，则不存在。