[发明专利]一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲基化DNA的检测方法，尤其涉及一种不易受干扰的甲基化DNA的检测方法。

背景技术

DNA甲基化是指DNA链上CpG位点的胞嘧啶（C）残基的5’碳上被修饰了一个甲基。DNA甲基化是最早发现的DNA修饰之一，是表观遗传学的重要组成部分。DNA甲基化特征性地发生在DNA链上的CpG二核苷酸的胞嘧啶（C）残基上，这常见于基因5’端表达调控序列。DNA甲基化在基因表达的调控中具有重要作用，参与了动物胚胎发育、基因印记和X染色体失活等过程。研究表明，DNA甲基化的改变能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及蛋白质互相作用方式的改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素。CpG岛局部甲基化水平的异常升高，可以导致基因组的不稳定和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率就会提高。所以DNA甲基化引人注目的地方就是在肿瘤的早期检测中的应用，因为研究表明表观遗传的变化伴随肿瘤的发生与发展，检测DNA甲基化的改变可以有助于肿瘤的早期发现。

目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此DNA甲基化的检测可以用于肿瘤发生的早期预测。

CpG岛甲基化的检测方法众多，其原理分别基于甲基化敏感的限制性内切酶消化法和基于亚硫酸钠修饰DNA的PCR检测法。甲基化敏感性限制性内切酶/Southern法（methylation-sensitive restriction Endonuclease/Southern， MSRE- Southern）是比较传统的方法，灵敏度低，样品需要量大。甲基化DNA特异性PCR法（Methylation Specific PCR，MSP）及其衍生的甲基化DNA检测方法，是目前检测DNA甲基化的常用方法，具有较高的灵敏度，但是假阳性率也很高。

发明内容

本发明提供了一种基于解链曲线的甲基化DNA检测方法。该方法能够有效地排除非甲基化DNA的影响，使样品中的甲基化DNA得以富集，用以解决现有技术检测灵敏度低、方法复杂、容易被干扰的缺点。

本发明甲基化DNA检测方法，步骤如下：

步骤1，采用亚硫酸盐处理待测DNA，和标准非甲基化DNA与标准甲基化DNA；

步骤2，在所要检测的基因序列中，选择富含CpG位点的一段序列作为目标检测序列，并以所选序列的5’端的一部分作为正向PCR引物，以所选序列3’端的一段序列的互补序列作为反向PCR引物；

步骤3，用亚硫酸盐处理过的标准甲基化DNA和非甲基化DNA作为PCR模板，加入DNA聚合酶，以荧光染料为指示剂，用所述正向PCR引物和反向PCR引物，在PCR扩增仪中进行扩增，并分别测定扩增产物的解链温度；

步骤4，在与步骤3相同的条件下，用所述PCR引物对待测DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

步骤5，将步骤4所得PCR扩增产物进行加热，使加热温度处于标准非甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度和标准甲基化DNA相应的PCR扩增产物的解链温度之间；

步骤6，立即将步骤5中的加热产物进行冷却，并用单链DNA特异性DNA内切酶将冷却后的体系进行消化；

步骤7，将步骤6所得消化产物作为PCR反应模板，使用所述正向PCR引物和反向PCR引物进行实时定量PCR扩增，并进行解链曲线测定；

步骤8，判断是否存在甲基化DNA，判断方法为：如果在待测DNA样品中检测到与标准甲基化DNA相应PCR产物相一致的特征性解链曲线，则待测样品中存在甲基化DNA；反之，则不存在。  

所述步骤1中，亚硫酸盐优选为亚硫酸钠，所述亚硫酸盐处理待测DNA的处理方法为，以0.3M的NaOH变性待测DNA，加入由5M亚硫酸钠、0.5mM氢醌组成的pH值为5.0的混合液，60℃避光温浴4小时；脱硫并纯化DNA。

所述步骤2中，PCR引物设计方法优选为：使所设计的PCR引物为18~32碱基长度，引物序列中CpG位点数量为0~3个，且所设计的引物的3’端的最后一个碱基不处于CpG的C的位置；同时使PCR扩增后的DNA片段大小为80~180碱基长度，并使PCR扩增的序列中含有尽可能多的CpG位点，一般应使PCR扩增序列含有8~20个CpG位点。