[发明专利]一种节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备和使用方法

摘要

一种节球藻毒素(NODLN)多抗免疫亲和柱(IAC)的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及藻毒素检测技术领域。本发明所研制的IAC是将NODLN多抗固定于柱中，从而吸附样品溶液中的NODLN，洗脱后起到富集和净化的效果，然后进HPLC进行定性定量分析。作为前处理过程，IAC富集优于现有的固相萃取(SPE)法。在HPLC图中显示NODLN多抗IAC能将NODLN的峰与其它杂质峰分开，不至影响测定结果，而SPE净化由于杂质太多，NODLN峰甚至难以分辨。由于NODLN多抗与NODLN能够特异性结合使IAC有很好的特异性，一次净化能除去绝大部分干扰物。而SPE无特异性，不能除去干扰物，从而影响最后的测定结果。

主权项

一种节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备方法，其特征是：(1)以节球藻毒素，以下简称NODLN，与牛血清白蛋白BSA偶联，偶联物以下简称NODLN‑BSA，作为人工抗原，兔疫获得NODLN抗血清，再采用饱和硫酸铵二步沉淀法纯化获得NODLN多抗；(2)琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化：用溴化氰法活化Sepharose 4B，活化过程如下：(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/LpH8.3的NaHCO3洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose 4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/LpH 8.3的NaHCO3抽洗；(3)节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备：NODLN多抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到亲和吸附剂，填入柱中制得NODLN多抗免疫亲和柱，操作步骤如下：(d)偶联将上述制备纯化好的NODLN多抗置于pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO3的偶联缓冲液中透析12h；将上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入NODLN多抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程；用5倍NODLN多抗溶液体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的NODLN多抗，得到琼脂糖‑抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上NODLN多抗的量；(e)封闭活性基团将琼脂糖‑抗体偶联复合物转入5倍体积pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris‑HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；(f)洗涤步骤(e)得到的琼脂糖‑抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH 4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris‑HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次；(g)防腐处理步骤(f)制备好的琼脂糖‑抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存；(h)装柱将步骤(f)或(g)得到的琼脂糖‑抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，制成NODLN多抗免疫亲和柱，即NODLN多抗IAC；(i)保存琼脂糖‑抗体偶联复合物或填充好的NODLN多抗IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内；(j)柱的再生柱使用后，用4‑10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris‑HCl缓冲液，和用4‑10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。