[发明专利]一种节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备和使用方法

权利要求书

1.一种节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备方法，其特征是：

(1)以节球藻毒素，以下简称NODLN，与牛血清白蛋白BSA偶联，偶联物以下简称NODLN-BSA，作为人工抗原，兔疫获得NODLN抗血清，再采用饱和硫酸铵二步沉淀法纯化获得NODLN多抗；

(2)琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化：用溴化氰法活化Sepharose 4B，活化过程如下：

(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/LpH8.3的NaHCO₃洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；

(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose 4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；

(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/LpH 8.3的NaHCO₃抽洗；

(3)节球藻毒素多抗免疫亲和柱的制备：

NODLN多抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到亲和吸附剂，填入柱中制得NODLN多抗免疫亲和柱，操作步骤如下：

(d)偶联

将上述制备纯化好的NODLN多抗置于pH 8.3含有0.5M NaCl的0.1M NaHCO₃的偶联缓冲液中透析12h；将上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入NODLN多抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程；用5倍NODLN多抗溶液体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的NODLN多抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上NODLN多抗的量；

(e)封闭活性基团

将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团；

(f)洗涤

步骤(e)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH 4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次；

(g)防腐处理

步骤(f)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃中密闭保存；

(h)装柱

将步骤(f)或(g)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，制成NODLN多抗免疫亲和柱，即NODLN多抗IAC；

(i)保存

琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的NODLN多抗IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内；

(j)柱的再生

柱使用后，用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5M NaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。

2.权利要求1所述方法制备的NODLN多抗免疫亲和柱的使用方法，其特征是实际水样中NODLN的测定，取0.2L受蓝藻污染的水样先通过0.45μm微孔滤膜过滤；IAC先依次用5mL甲醇，5mL蒸馏水，5mLPBS预处理；滤液过预处理后的NODLN多抗IAC；再依次用5mLPBS、5mL蒸馏水、5mL 10％甲醇淋洗杂质；最后用5mL纯甲醇洗脱；洗脱液减压蒸干，残留物用0.2mL PBS溶解后进HPLC分析；同时用固相萃取柱做对照实验。