[发明专利]一株降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法

摘要

一株降解2-氯苯酚的光合细菌的制备方法，包括以下步骤：1、富集培养基的配制；2、光合细菌的富集培养；3、降解2-氯苯酚的光合细菌的强化驯化；4、分离可降解2-氯苯酚的光合细菌；5、光合细菌的扩大培养；6、筛选菌株；7、紫外诱变；8、菌种鉴定。本发明具有对氧存在条件敏感度较低和不会对环境造成二次污染的特点。

主权项

一株降解2‑氯苯酚的光合细菌的制备方法，其特征是：其制备方法包括以下步骤：(1)、富集培养基的配制：将NH4Cl 0.5～2.5克，CH3COONa 0.5～5克，MgCl2 0.05～0.5克，CaCl2 0.05～0.5克，KH2PO4 0.2～1克，K2HPO4 0.2～1克，酵母膏0.05～2克加入到1000毫升蒸馏水中，用质量分数为10％的NaOH和10％的HCl调节pH 5.0～10.0，搅拌均匀，即配得光合细菌的富集培养基；(2)、光合细菌的富集培养：将富集培养基倒入500毫升的锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，然后取农药厂排污口下游水体浅层底泥样品2克置于250毫升无菌具塞细颈瓶中，添加含2‑氯苯酚质量浓度为25毫克/升的灭菌后富集培养基100毫升；盖紧瓶盖，将细颈瓶置于SPX‑300I‑G型微电脑光照培养箱中，在光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃，厌氧条件下培养至出现红色，获得光合细菌富集培养菌悬液a；(3)、降解2‑氯苯酚的光合细菌的强化驯化：从变至红色的富集培养菌悬液a中取5毫升，接入95毫升含2‑氯苯酚质量浓度为75毫克/升的新鲜无菌富集培养基中，在光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃，厌氧条件下培养至红色，由此得到第一次强化驯化培养液b1；依次提高富集培养基中2‑氯苯酚的质量浓度，按照上述方法连续培养5～8个周期，直至2‑氯苯酚在富集培养基中的的质量浓度达到320毫克/升，此时得到n次强化驯化培养液bn；(4)、分离可降解2‑氯苯酚的光合细菌：富集培养基中加入2～3％的琼脂，灭菌后倒入直径为9厘米的培养皿中，冷却后制得固体分离培养基平板，取1毫升n次强化驯化培养液bn滴到固体分离培养基平板上，用无菌三角刮刀涂布；在培养皿盖内侧放入0.2～1克焦性没食子酸和1～5毫升质量百分浓度为50％的过饱和Na2CO3溶液作为吸氧剂，将涂布后的固体分离培养基平板倒扣至盖内，用融化后的固体石蜡+液体石蜡按配比1∶1进行培养皿边缘密封，将密封后的培养皿倒置暗处2～5小时后拿出，再倒置于光照培养箱中，于光照度为1000～6000勒克斯，温度为15～40℃条件下光照厌氧培养；当厌氧培养5～7天后，平板上长出红紫色的小型菌落，挑取单个菌落重复划线分离多次，直至镜检观察细胞形态一致，此时认为获得纯菌；(5)、光合细菌的扩大培养：挑取上述固体分离培养基平板上的各红色单菌落，分别用含2‑氯苯酚浓度为100毫克/升的富集培养基进行扩大培养；培养7天后，培养瓶中的菌液都变为红色，由此得到各菌体的扩大培养液d；(6)、筛选菌株：测定各个菌株的扩大培养液d中2‑氯苯酚的质量浓度，选择2‑氯苯酚质量浓度最低的扩大培养液中的菌株作为后续研究对象，菌株编号为1D；(7)、紫外诱变：培养70小时的编号为1D的菌株培养液以10000转/分钟的转速离心5分钟，倾去上清液，菌体打散后加入无菌生理盐水，离心后倾去上清液；离心菌体中加入无菌生理盐水，将其浓度调整至每毫升108个左右，由此制得菌悬液e；移取5毫升菌悬液e到直径9厘米的培养皿内，放入灭菌的搅拌转子，将培养皿置于磁力搅拌器上，18瓦紫外灯下垂直距离25厘米处照射10～100秒，由此得照射后菌悬液f，取0.5毫升紫外光照射后的菌悬液f涂布于固体分离培养基平板上进行厌氧光照培养，定期观察，7天后从固体平板中挑取出现较早、生长速率较快的单菌落，即得诱变菌株，编号为PSB‑1D；(8)、菌种鉴定：对菌株PSB‑1D的细胞形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列进行测定；测定结果表明，菌株PSB‑1D属于为沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。该菌株为已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。