[发明专利]慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统

摘要

本发明公开了慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统，可用来制备转基因猪，属于基因工程领域。猪生长激素(pGH)具有刺激骨及软骨组织生长、调节蛋白质、脂类和糖类代谢的功能，能显著提高猪的生长速度、瘦肉率和饲料报酬，但以往的转生长激素基因动物G H在体内表达量和表达时间不受调控，结果导致很多生理性的疾病，得不偿失。本发明首先构建了强力霉素调控的pGH双质粒诱导表达系统，其次将双质粒改造为单质粒诱导表达系统，调控猪GH定时定量表达，在转基因动物中首次报道，其次将单质粒诱导表达系统中调控表达的DNA功能片段插入慢病毒载体，采用慢病毒介导该外源基因进入动物细胞，提高了转基因效率。mRNA分析表明该系统可以使猪的GH基因实现严密的诱导表达。

主权项

慢病毒介导的猪生长激素pGH单质粒诱导表达系统，是由以下方法获得的：1)pTRE‑Tight‑BI‑GH表达质粒的构建设计猪生长激素引物：PrimerlGTGGATCCCTCAGCTCACCGGCPrimer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA划线部分分别为上游引物和下游引物添加的BamH I和Sal I酶切位点；以猪垂体总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性2min，98℃变性10s，57℃复性15s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃5min，4℃恒温，PCR产物为696bp；将PCR扩增获得带有BamH I和Sal I位点的编码GH序列的PCR产物和pTRE‑Tight‑BI分别用BamH I和Sal I进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，质粒和插入片段按摩尔比1∶3混合于4℃，T4连接酶16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE‑Tight‑BI‑GH质粒的菌液；2)pTRE‑Tight‑BI‑GH‑rtTA‑Advanced表达质粒的构建设计rtTA‑Advanced片段引物：Primer3TGACCTCCATAGAAGACACCPrimer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC划线部分为下游引物添加的Bgl II酶切位点，在扩增产物中47bp处包含EcoR I的酶切位点，以浓度为1ng/μl pTet‑onAdvanced质粒作为模板，扩增rtTA‑Advanced片段，PCR产物为770bp；将PCR扩增获得带有EcoR I和Bgl II位点的编码rtTA‑Advanced序列的PCR产物和pTRE‑Tight‑BI‑GH分别用EcoR I和Bgl II进行双酶切，再次电泳凝胶纯化回收，测定浓度，质粒和插入片段按摩尔比1∶3.5混合于4℃，T4连接酶(购自TAKARA公司)16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE‑Tight‑BI‑GH‑rtTA‑Advanced质粒的菌液；3)pLenti‑TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced质粒的构建设计pLenti骨架引物：Primer5GCGACTTCCAGTTCAAPrimer6CTAGACTAGTCTGCACCTTGTTCTTCTAT划线部分为下游引物添加的Spe I酶切位点，以浓度为1ng/μl pLenti6/V5‑GW/lacZ质粒作为模板，扩增pLenti骨架，PCR产物为6549bp，在扩增产物中297bp处包含SacII的酶切位点；设计TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced功能片段引物：Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAAPrimer8TCCCCGCGGCGACCAGCAACTAGAAGGCA划线部分分别为上游引物和下游引物添加的Spe I和SacII酶切位点，以浓度为1ng/μl pTRE‑Tight‑BI‑GH‑rtTA‑Advanced质粒作为模板，扩增2109bp的TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced功能片段，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD‑19载体，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTA‑TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advan ced质粒的菌液；将PCR扩增获得带有Spe I和SacII酶切位点的pLenti质粒骨架DNA和pTA‑TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced质粒分别用Spe I和Sac II进行双酶切，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收，测定浓度，按1∶3比例混合于4℃，T4连接酶16℃连接过夜，热激转化到DH5α大肠杆菌中37℃培养过夜，利用PCR和Nru I酶切筛选鉴定阳性克隆，得到含pLenti‑TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced质粒的菌液；4)pLenti‑TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced病毒生产(1)转染前一天，用1ml质量比0.25％胰酶消化293Ft细胞，按1∶4的比例传到4个T75cm2培养瓶中，加入10ml不含抗生素的293FT培养基，放入37℃含体积比5％CO2培养箱进行培养；(2)转染当天，待细胞达到体积比70‑90％融合度时，移除培养液，加入6ml无抗生素的293FT培养基；以一个T75cm2培养瓶用量为例制备DNA一脂质体转染复合物：在一个无菌的15ml离心管中，将9μg ViraPowerTM Packaging Mix及3.5μg pLenti‑TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced质粒，共12μgDNA，加入到1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻混匀，待用；取另一无菌15ml离心管，将40μl的脂质体LipofectamineTM 2000加入1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻吹吸混匀，迅速与上一步的混合液混合，并轻轻混匀，室温孵育20分钟，以形成DNA‑脂质体转染复合物；(3)将转染复合物逐滴加入培养瓶中，并来回轻摇以混匀，37℃培养6～12小时后，换上10ml新的完全293FT无抗生素培养基；(4)转染后72小时收集含病毒的上清到无菌有盖的15ml的尖底离心管内；(5)4℃3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀；取上清，用0.45μm滤器抽滤；抽滤过的病毒原液经4℃保存备用，即为所获得的慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统pLenti‑TRE‑Tight‑GH‑rtTA‑Advanced病毒。