[发明专利]慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统

说明书

技术领域

本发明构建了慢病毒介导的猪生长激素(pig growth hormone，pGH)单质粒诱导表达系统，属于基因工程领域，具体地讲该方法的的进一步应用可以为生产安全的，瘦肉节粮且生长速度可调控的转GH基因猪做好铺垫。

背景技术

(一)生长激素

生长激素(growth hormone)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的单链多肽激素，具有促进物质代谢与生长发育的作用，对机体各器官和组织均有影响，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节糖类、脂类和蛋白质三大物质代谢。

在个体生长发育过程中，生长激素是起关键作用的激素，幼年动物缺少GH，会出现生长停滞、身材矮小，在人类表现为侏儒症；成年动物体内的GH会随着年龄的增长而减少，其结果是机体逐渐衰老，成人GH缺乏症表现为皮肤菲薄、肌肉重量减轻、脂肪及总体重增加、骨质疏松、心肾功能降低、凝血机制异常、免疫功能和性功能低下，神经兴奋降低及精神抑郁等[1]。幼年动物GH分泌过多，表现为巨人症；成年动物GH分泌过多，由于骨骺闭合，长骨不再生长，而肢端短骨、面骨及其软骨组织则生长异常，以致出现手足粗大、鼻大、唇厚及内脏器官增大的肢端肥大症。GH的促生长作用主要是通过其诱导靶细胞产生生长素介质(somatomedin，SM)来实现的，SM的化学结构与胰岛素近似，又称胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)。IGF的作用是促进软骨生长，它通过促进钙、磷、钠、钾、硫等多种元素进入软骨组织，以及氨基酸进入软骨细胞，增强DNA、RNA和蛋白质的合成，促进软骨组织增殖和骨化，使长骨加长，也能刺激多种组织细胞有丝分裂。

自从1982年Palmiter等人获得快速生长的“超级小鼠”后，人们对生长激素的转移产生了极大的兴趣，目前已获得转GH基因猪、小鼠、兔、鱼等动物。有研究报道，Hammer等将人的生长激素基因导入猪、兔、绵羊后，分别得到三种动物的整合个体，猪和兔体内得到了表达；史瀛仙等将人生长激素和小鼠MT基因融合注入团头鲂和鲤鱼的受精卵，经检测表明hGH基因在受体鱼中得到整合、转录、翻译、表达，并且具有显著的促生长效应[2]。

将猪生长激素(pGH)转入猪、鼠、兔体内，发现得到的转基因猪、鼠和兔生长速度均有明显提高，且得到的转基因阳性猪可以将导入基因部分的遗传给后代，F1代猪亦表现出较好的生产性状。转猪生长激素(pGH)的金鱼，不仅pGH基因得到表达，而且可通过有性繁殖传递给后代。在转牛生长激素(bGH)基因注入小鼠受精卵，结果转入的GH基因对育成的转基因小鼠具有明显的促生长作用，GH基因的表达具有明显的组织特异性。将牛和羊的生长激素基因导入鲤鱼受精卵，获得转基因鲤鱼，实验证明外源基因可以遗传给后代，并对受体鱼有明显的促生长作用[3]。

目前通过基因重组技术成功合成了人生长激素(RhGH)，其结构与人的GH相似，具有促进物质代谢和组织细胞生长、发育、增殖、分化，调节免疫及代谢作用，目前已被广泛用于治疗慢性肝病、改善严重创伤、烧伤、慢性阻塞性肺病等疾病领域，在减肥、抗衰老、美容等领域也在迅速增长。

GH虽具有的促生长功能以及潜在的价值，但是转GH基因动物还存在诸多问题。难以控制转入基因在宿主基因组中的行为，以及存在的安全性问题都将是面临的考验。

(二)Tet-on诱导表达系统

GOSSEN等[56]建立的四环素表达调控系统，(Tet基因表达调控系统)，高效无毒，具有严密的开关功能。该系统基础表达水平低，诱导表达水平高；调控特异性高，宿主基因不受影响；诱导剂无相关毒性；适用范围广泛，可穿越胎盘屏障和分泌进乳汁，尤其适合转基因研究；存在剂量依赖性，可定时定量诱导表达。应用于大多数真核细胞的一般为双质粒调控的表达系统，即由调节质粒和反应质粒组成。其中，在四环素的衍生物强力霉素(Doxycycline，Dox)存在下，Tet-on基因表达系统可以诱导插入启动子下游的目的基因高效表达。目前认为，Tet-on基因表达系统是最为理想的真核生物基因诱导表达系统，随着人们对该系统的不断的研究和改造，该系统的功能和组成都得到了提高和优化，pTRE-Tight-BI质粒含有两个受同一TRE-mod调控的反向的迷你型CMV启动子，可同时诱导两个不同基因的表达。

(三)慢病毒