[发明专利]一种拟南芥的定点整合转基因方法

摘要

本发明公开了一种拟南芥的定点整合转基因方法，通过花期喷雾法，利用农杆菌将靶位点整合到目的植株的基因组中，筛选出单拷贝杂合体转基因植株后，再一次通过花期喷雾法，利用农杆菌将目的基因整合到筛选出的单拷贝杂合体转基因植株的基因组中，筛选出定点整合纯合体植株，即为成功定点整合植株。对拟南芥采用该定点整合转基因方法，转化率高，且周期短。

主权项

一种拟南芥的定点整合转基因方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)制备含有靶位点loxP的农杆菌：将启动子‑loxP‑Cre编码框的结构插入到表达载体中，再将该载体导入农杆菌中，制得含有靶位点的农杆菌，其中表达载体中含有抗性筛选标记基因；(2)将步骤(1)中制备的农杆菌用渗透培养基悬浮；(3)在活体条件下进行花期喷雾法转化：将步骤(2)中含有悬浮农杆菌的渗透培养基喷洒于拟南芥花序上，利用农杆菌将靶位点整合到目的植株基因组中；(4)T1代转化株的筛选及检测：将步骤(3)中转化后的植株采取单株收种，得到T0代种子，在培育过程中进行抗性筛选得到具有抗性的第一代植株T1；对抗性植株T1采取单株收种，通过T1代植株的子一代的抗性分离比，筛选出子一代抗性分离比为3∶1的单拷贝转基因植株；对筛选出的单拷贝转基因植株进行分子检测，筛选出杂合体转基因植株，作为靶植株；(5)制备含有目的基因的农杆菌：将loxP‑缺失启动子的抗性筛选标记基因‑目的基因‑loxP的结构插入到表达载体中，再将该载体导入农杆菌中，制得含有目的基因的农杆菌；其中该抗性筛选标记基因不同于步骤(1)中所使用的抗性筛选标记基因；(6)将步骤(5)中制得的农杆菌用渗透培养基悬浮；(7)花期喷雾法介导目的基因的定点整合：将(6)中含有悬浮农杆菌的渗透培育基喷洒于步骤(4)中筛选得到的靶植株的花序上，利用农杆菌将目的基因定点整合到靶位点上；(8)定点整合植株的筛选及检测：将步骤(7)中整合后的植株采取单株收种，得到F0代种子，在培养过程中进行抗性筛选得到具有抗性的第一代植株F1；对抗性植株F1采取单株收种，通过对F1代植株的子一代的抗性分离比观察，筛选出未出现子一代抗性分离的定点整合纯合体植株，即为成功定点整合植株。