[发明专利]一种拟南芥的定点整合转基因方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)的定点整合转基因方法。

背景技术

在转基因植物中，当外源基因随机整合到宿主染色体上时，由于染色体的位置效应或是基因的拷贝数不同，会造成外源基因表达水平存在一定的差异，并且可能导致宿主本身所含基因的失活。而在高等真核生物中，外源基因在染色体上整合时，随机整合的机率要高于同源重组10²～10⁵倍。定点整合系统能够在植物遗传转化中更准确、可靠的操纵外源DNA的引入，它能产生外源基因的定点重组，既可以提高外源基因的整合效率又可以提高整合位置的准确性，已成为植物遗传操作中的重要工具。其中，Cre/loxp是在植物中研究得最为深入和广泛的一个定点整合系统。

定点整合系统已由各种转基因技术成功应用于植物研究中，如PEG介导的烟草原生质体转化，农杆菌介导的拟南芥根外植体转化，基因枪介导的水稻和大豆转化等。

目前的转基因技术可分为物理法、化学法及生物学法。无论哪一种方法，都要依靠转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养植株再生过程，实现外源基因的转移，从而获得转基因植株。但该途径存在一系列局限性，如组织培养及转化再生能力的基因型依赖性比较强，而且有些物种难于进行组织培养，以及转化率低下、过敏反应导致感染部位的褐化坏死、细胞脱分化和再分化中产生的体细胞变异以及转基因株的育性降低或丧失都有可能干扰转基因植株的分析及应用。植物原位转基因方法是一种不需要组织或细胞培养手段而达到植物在活体而非立体手段状态下的转化。拟南芥是一种典型的模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，但目前主要应用于其定点整合系统的方法还停留在常规的根外植体转化方法上，转化效率低。

发明内容

本发明提供了一种拟南芥的定点整合转基因方法，通过花期喷雾法，在活体条件下，将拟南芥花序与农杆菌接触，完成遗传细胞的转化，并通过对后代的筛选，获得转化植株，解决了拟南芥采用常规组织培养转化法转化效率低，实验周期长的问题。

为了达到上述目的，本发明提供了一种拟南芥的定点整合转基因方法，包括花枝的生长。之后4-6天就可以进行转化，这时拟南芥有很多未成熟的花，角果很少。

使用喷雾器，将步骤(2)中制备的悬浮于渗透培养基的农杆菌菌液均匀地喷洒于供转化植株花序上。侵染过程结束后，所有花序都已被浸润，用透明塑料立盖将处理过的植株覆盖过夜，以保持一定的湿度。

整个花期喷雾过程每隔一天进行一次，共重复三次。每次侵染后均需覆盖。(4)T1代转化株的筛选及检测

转化后其他管理按照常规技术进行，直至种子成熟，收获。每个转化植株都采取单株收种(T0代种子)，对T1代进行筛选及其它检测。

a、T1代转化株的抗生素筛选

将收获的T0代种子，于常规条件下萌发，7-10天后用去离子水稀释1000倍的Basta喷洒进行筛选，筛选过程每隔两天进行一次，共重复两次。转化株由于带有Bar抗性基因而对basta不敏感。筛选出的抗性植株继续生长至成熟收获。每个抗性植株T1都采取单株收种。两周后选取抗性植株，

b、单拷贝转基因植株的筛选

根据孟德尔遗传分离定律，单拷见基因将在子一代中表现出3∶1的性状分离。将收获的T1代种子于常规条件下萌发，7-10天后用去离子水稀释1000倍的Basta喷洒进行筛选，筛选过程每隔两天进行一次，共重复两次。统计抗性与敏感植株数，符合抗性植株∶敏感植株＝3∶1的植株即为单拷贝转基因植株，并进行进一步的分子检测。。

c、单拷贝杂合体转基因植株的筛选

对单拷贝转基因植株，用巢式PCR试剂盒(Vectorette II Kit)进行T-DNA插入位点的基因组定位。植物基因组DNA的提取用植物基因组DNA提取试剂盒(DNeasy miniprep kit)进行。方法均参照试剂盒提供的方法进行。根据含有靶基因的表达载体的T-DNA区域设计两个巢式引物序列如下，部分成功定位的结果见表1。

SDM2355′CTACACCCACCTGCTGAAGT 3′

SDM245′GTCCTGCCCGTCACCGAGAT  3′

表1部分转化植株的T-DNA插入位点的基因组定位

根据上述定位结果，由插入两侧及T-DNA序列设计三引物PCR，在对应的T2代个体中筛选杂合个体，作为下一步的外源基因定点整合的靶植株。

(5)制备含有目的基因的农杆菌