[发明专利]注射用黄芪皂苷中单体化合物的分离方法

摘要

本发明公开了一种注射用黄芪皂苷中单体化合物的分离方法，本发明分离得到的单体化合物通过标准品比对、质谱、核磁共振氢谱和核磁共振碳谱等常规手段进行了结构鉴定，本发明所述的黄芪皂苷单体化合物可以用于注射用黄芪皂苷的质量控制，使该注射剂的化学物质基础更清楚，提高用药安全。

主权项

一种注射用黄芪皂苷中单体化合物的分离方法，其特征在于该方法包括如下步骤：将药物原料黄芪用体积浓度为40％‑95％的含水乙醇回流提取，提取液除去乙醇，重新加入乙醇至混合溶液的乙醇体积含量至40％‑95％进行沉淀和过滤，滤液调节至pH6.0‑11.0后进行沉淀过滤，将滤液调节至pH 6.0‑8.0后，按原料药/水重量比为0.5‑3/1的量加水混合，在保持不冻结的低温条件下沉淀后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附，用浓度为50％‑90％的含水乙醇解吸附洗脱并收集，将除去乙醇后的解吸附浓缩溶液调节pH至9.0‑13.0后，用经水饱和的正丁醇提取，提取液除去正丁醇后用丙酮和乙醚中的至少一种进行沉淀，分离沉淀物为供注射剂用的黄芪皂苷；取黄芪皂苷100‑300重量份，用5‑10重量倍的水分散，用分析纯的乙酸乙酯萃取2‑5次，每次用量为2‑5重量倍，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物15‑50重量份；萃取后的水相用分析纯的正丁醇萃取2‑5次，每次用量为2‑5重量倍，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇得到正丁醇萃取物60‑200重量份；将乙酸乙酯萃取物15‑50重量份经正相硅胶柱层析分离，体积比为95‑100∶0‑5→50‑65∶35‑50的氯仿‑甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为5‑10倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为10‑20∶0.8‑1.2和2‑6∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前1.25‑2.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份A，依次接下来的0.75‑1.5倍柱体积、0.5‑1倍柱体积、0.5‑1倍柱体积、0.75‑1.5倍柱体积、1.25‑2.5倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份B、组份C、组份D、组份E和组份F，回收溶剂后，分别得到组份A 0.1‑0.5重量份、组份B1.2‑4.8重量份、组份C 2‑9重量份、组份D4‑13重量份、组份E1‑5重量份、组份F 1‑6重量份6个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将正丁醇萃取物60‑200重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为85‑90∶10‑15→30‑35∶65‑70氯仿‑甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为5‑10倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为8‑12∶0.8‑1.2和2‑5∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前1.5‑3倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份G，依次接下来的1‑2倍柱体积、0.5‑1倍柱体积、0.5‑1倍柱体积、1.5‑3倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份H、组份I、组份J和组份K，回收溶剂后，得到组份G 1‑5重量份、组份H 3‑12重量份、组份I 8‑30重量份、组份J12‑40重量份、组份K 2‑9重量份5个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份A 0.1‑0.5重量份经正相硅胶柱层析分离，用分析纯的氯仿洗脱，洗脱液用量为8‑12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为8‑12∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.2‑4.8倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份A‑1，依次接下来的0.8‑1.2倍柱体积、4‑6倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份A‑2和组份A‑3，将其中组分A‑2回收溶剂后，得到单体化合物10‑50mg，经结构鉴定为：10‑甲氧基美迪紫檀素，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份B 1.2‑4.8重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为95‑100∶0‑5→50‑65∶35‑50的氯仿‑甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为8‑12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为4‑8∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.2‑4.8倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份B‑1，依次接下来的1.6‑2.4倍柱体积、3.2‑4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份B‑2和组份B‑3，将其中组分B‑2回收溶剂后，再用80‑120体积份甲醇重结晶得到单体化合物90‑320mg，经结构鉴定为：胡萝卜苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份C 2‑9重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为95‑100∶0‑5→50‑60∶40‑50的氯仿‑甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为8‑12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为4‑8∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前2.4‑3.6倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C‑1，依次接下来的2.4‑3.6倍柱体积、3.2‑4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C‑2和组份C‑3，回收溶剂后，得到组份C‑1 0.2‑1.2重量份、组份C‑2 0.5‑1.5重量份、组份C‑3 1‑4重量份3个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份C‑1 0.2‑1.2重量份经Sephadex LH‑20凝胶柱层析分离，用分析纯的甲醇洗脱，洗脱液用量为10‑15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为4‑8∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3‑4.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C‑1‑1，依次接下来的1‑1.5倍柱体积、6‑9倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C‑1‑2和组份C‑1‑3，将其中组分C‑1‑2回收溶剂后，得到单体化合物50‑200mg，经结构鉴定为：乙酰黄芪皂苷I，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份C‑2 0.5‑1.5重量份经Sephadex LH‑20凝胶柱层析分离，用分析纯的甲醇洗脱，洗脱液用量为10‑15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为3‑8∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前5‑7.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C‑2‑1，依次接下来的2‑3倍柱体积、3‑4.5倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C‑2‑2和组份C‑2‑3，将其中组分C‑2‑2回收溶剂后，得到单体化合物100‑420mg，经结构鉴定为：2‑羟基‑3，4‑二甲氧基异黄烷‑7‑O‑β‑D吡喃葡萄糖苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版‑部附录VIB；将组份C‑3 1‑4重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为90‑100∶0‑10→50‑55∶45‑50的氯仿‑甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为10‑15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为3‑8∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3‑4.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C‑3‑1，依次接下来的2.5‑3.75倍柱体积、4.5‑6.75倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C‑3‑2和组份C‑3‑3，将其中组分C‑3‑2回收溶剂后，得到单体化合物0.3‑1.5g，经结构鉴定为：9，10‑二甲氧基紫檀烷‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份E 1‑5重量份经40‑60体积份的甲醇重结晶得到单体化合物0.5‑2.5g，经结构鉴定为：毛蕊异黄酮‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷；将组份F 1‑6重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为90‑100∶0‑10→50‑55∶45‑50的氯仿‑甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为8‑12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2‑6∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.6‑5.4倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份F‑1，依次接下来的1.2‑1.8倍柱体积、3.2‑4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份F‑2和组份F‑3，将组分F‑2回收溶剂后，得到单体化合物0.5‑3.5g，经结构鉴定为：黄芪甲苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份H 3‑12重量份经80‑120体积份的甲醇重结晶得到单体化合物1.5‑6g，经结构鉴定为：芒柄花苷；将组份K 2‑9重量份经Sephadex LH‑20凝胶柱层析分离，用分析纯的甲醇洗脱，洗脱液用量为8‑12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2‑5∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前4.8‑7.2倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份K‑1，接下来的3.2‑4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，收集为组份K‑2，回收溶剂后，得到组份K‑1 1‑3重量份、组份K‑20.5‑3重量份2个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份K‑1 1‑3重量份经反相C18硅胶柱层析分离，以体积比为10‑15∶85‑90→85‑90∶10‑15的甲醇‑水梯度洗脱，洗脱液用量为10‑15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2‑5∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前4‑6倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份K‑1‑1，依次接下来的0.8‑1.25倍柱体积、5.2‑7.75倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份K‑1‑2和组份K‑1‑3，将组分K‑1‑2回收溶剂后，得到单体化合物90‑340mg，经结构鉴定为：Cyclocanthoside E；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；将组份K‑2 0.5‑3重量份经反相C18硅胶柱层析分离，以体积比为10‑15∶85‑90→85‑90∶10‑15的甲醇‑水梯度洗脱，洗脱液用量为10‑15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2‑5∶0.8‑1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.5‑5.2倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份K‑2‑1，依次接下来的1.2‑1.8倍柱体积、5.3‑8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份K‑2‑2和组份K‑2‑3，将组分K‑2‑2回收溶剂后，得到单体化合物60‑250mg，经结构鉴定为：黄芪皂苷VI；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB。