[发明专利]注射用黄芪皂苷中单体化合物的分离方法

权利要求书

1.一种注射用黄芪皂苷中单体化合物的分离方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

将药物原料黄芪用体积浓度为40％-95％的含水乙醇回流提取，提取液除去乙醇，重新加入乙醇至混合溶液的乙醇体积含量至40％-95％进行沉淀和过滤，滤液调节至pH6.0-11.0后进行沉淀过滤，将滤液调节至pH 6.0-8.0后，按原料药/水重量比为0.5-3/1的量加水混合，在保持不冻结的低温条件下沉淀后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附，用浓度为50％-90％的含水乙醇解吸附洗脱并收集，将除去乙醇后的解吸附浓缩溶液调节pH至9.0-13.0后，用经水饱和的正丁醇提取，提取液除去正丁醇后用丙酮和乙醚中的至少一种进行沉淀，分离沉淀物为供注射剂用的黄芪皂苷；

取黄芪皂苷100-300重量份，用5-10重量倍的水分散，用分析纯的乙酸乙酯萃取2-5次，每次用量为2-5重量倍，合并乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯萃取物15-50重量份；萃取后的水相用分析纯的正丁醇萃取2-5次，每次用量为2-5重量倍，合并正丁醇萃取液，回收正丁醇得到正丁醇萃取物60-200重量份；

将乙酸乙酯萃取物15-50重量份经正相硅胶柱层析分离，体积比为95-100∶0-5→50-65∶35-50的氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为5-10倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为10-20∶0.8-1.2和2-6∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前1.25-2.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份A，依次接下来的0.75-1.5倍柱体积、0.5-1倍柱体积、0.5-1倍柱体积、0.75-1.5倍柱体积、1.25-2.5倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份B、组份C、组份D、组份E和组份F，回收溶剂后，分别得到组份A 0.1-0.5重量份、组份B1.2-4.8重量份、组份C 2-9重量份、组份D4-13重量份、组份E1-5重量份、组份F 1-6重量份6个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将正丁醇萃取物60-200重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为85-90∶10-15→30-35∶65-70氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为5-10倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为8-12∶0.8-1.2和2-5∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前1.5-3倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份G，依次接下来的1-2倍柱体积、0.5-1倍柱体积、0.5-1倍柱体积、1.5-3倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份H、组份I、组份J和组份K，回收溶剂后，得到组份G 1-5重量份、组份H 3-12重量份、组份I 8-30重量份、组份J12-40重量份、组份K 2-9重量份5个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份A 0.1-0.5重量份经正相硅胶柱层析分离，用分析纯的氯仿洗脱，洗脱液用量为8-12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为8-12∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.2-4.8倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份A-1，依次接下来的0.8-1.2倍柱体积、4-6倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份A-2和组份A-3，将其中组分A-2回收溶剂后，得到单体化合物10-50mg，经结构鉴定为：10-甲氧基美迪紫檀素，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份B 1.2-4.8重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为95-100∶0-5→50-65∶35-50的氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为8-12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为4-8∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.2-4.8倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份B-1，依次接下来的1.6-2.4倍柱体积、3.2-4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份B-2和组份B-3，将其中组分B-2回收溶剂后，再用80-120体积份甲醇重结晶得到单体化合物90-320mg，经结构鉴定为：胡萝卜苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份C 2-9重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为95-100∶0-5→50-60∶40-50的氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为8-12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为4-8∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前2.4-3.6倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C-1，依次接下来的2.4-3.6倍柱体积、3.2-4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C-2和组份C-3，回收溶剂后，得到组份C-1 0.2-1.2重量份、组份C-2 0.5-1.5重量份、组份C-3 1-4重量份3个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份C-1 0.2-1.2重量份经Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，用分析纯的甲醇洗脱，洗脱液用量为10-15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为4-8∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3-4.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C-1-1，依次接下来的1-1.5倍柱体积、6-9倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C-1-2和组份C-1-3，将其中组分C-1-2回收溶剂后，得到单体化合物50-200mg，经结构鉴定为：乙酰黄芪皂苷I，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份C-2 0.5-1.5重量份经Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，用分析纯的甲醇洗脱，洗脱液用量为10-15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为3-8∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前5-7.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C-2-1，依次接下来的2-3倍柱体积、3-4.5倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C-2-2和组份C-2-3，将其中组分C-2-2回收溶剂后，得到单体化合物100-420mg，经结构鉴定为：2-羟基-3，4-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D吡喃葡萄糖苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版-部附录VIB；

将组份C-3 1-4重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为90-100∶0-10→50-55∶45-50的氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为10-15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为3-8∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3-4.5倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份C-3-1，依次接下来的2.5-3.75倍柱体积、4.5-6.75倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份C-3-2和组份C-3-3，将其中组分C-3-2回收溶剂后，得到单体化合物0.3-1.5g，经结构鉴定为：9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份E 1-5重量份经40-60体积份的甲醇重结晶得到单体化合物0.5-2.5g，经结构鉴定为：毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷；

将组份F 1-6重量份经正相硅胶柱层析分离，以体积比为90-100∶0-10→50-55∶45-50的氯仿-甲醇梯度洗脱，洗脱液用量为8-12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2-6∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.6-5.4倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份F-1，依次接下来的1.2-1.8倍柱体积、3.2-4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份F-2和组份F-3，将组分F-2回收溶剂后，得到单体化合物0.5-3.5g，经结构鉴定为：黄芪甲苷；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份H 3-12重量份经80-120体积份的甲醇重结晶得到单体化合物1.5-6g，经结构鉴定为：芒柄花苷；

将组份K 2-9重量份经Sephadex LH-20凝胶柱层析分离，用分析纯的甲醇洗脱，洗脱液用量为8-12倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2-5∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前4.8-7.2倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份K-1，接下来的3.2-4.8倍柱体积的洗脱液斑点相近，收集为组份K-2，回收溶剂后，得到组份K-1 1-3重量份、组份K-20.5-3重量份2个组份，其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份K-1 1-3重量份经反相C18硅胶柱层析分离，以体积比为10-15∶85-90→85-90∶10-15的甲醇-水梯度洗脱，洗脱液用量为10-15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2-5∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前4-6倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份K-1-1，依次接下来的0.8-1.25倍柱体积、5.2-7.75倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份K-1-2和组份K-1-3，将组分K-1-2回收溶剂后，得到单体化合物90-340mg，经结构鉴定为：Cyclocanthoside E；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB；

将组份K-2 0.5-3重量份经反相C18硅胶柱层析分离，以体积比为10-15∶85-90→85-90∶10-15的甲醇-水梯度洗脱，洗脱液用量为10-15倍柱体积，在洗脱过程中，一边洗脱一边以每次0.1个柱体积的洗脱液进行正相硅胶薄层层析检查，以体积比为2-5∶0.8-1.2的氯仿∶甲醇为展开剂，结果显示，前3.5-5.2倍柱体积的洗脱液的斑点相近，收集为组份K-2-1，依次接下来的1.2-1.8倍柱体积、5.3-8倍柱体积的洗脱液斑点相近，分别收集为组份K-2-2和组份K-2-3，将组分K-2-2回收溶剂后，得到单体化合物60-250mg，经结构鉴定为：黄芪皂苷VI；其中所述的正相硅胶薄层层析检查参照《中国药典》2005年版一部附录VIB。