[发明专利]供体角膜HBV和TP的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

一种供体角膜HBV和TP的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。试剂盒由DNA提取试剂、DNA扩增试剂和阳性工作标准品组成。其中DNA扩增试剂包括预混试剂，20X荧光探针增强剂，正、反向HBV引物，HBV荧光探针，正、反向TP引物，TP荧光探针，无核酸酶的蒸馏水，HBV和TP阴性对照与阳性对照；阳性工作标准品为含有HBV正、反向引物扩增的目的序列pUC57-HBV质粒，含有TP正、反向引物扩增的目的序列pUC57-TP质粒。本发明实现了对临床供体结膜组织标本的完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染；同时采用实时检测，所得Ct值和原始模板数量完全呈线性相关，定量准确率极高，相对误差约为50％，足以适应临床核酸定量的要求。

主权项

一种供体角膜HBV和TP的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒由DNA提取试剂、DNA扩增试剂和阳性工作标准品组成；其中DNA提取试剂为硅胶膜通用型DNA小提试剂盒；DNA扩增试剂包括2.5X PCR预混试剂，20X荧光探针增强剂，正向及反向HBV引物，HBV荧光探针，正向及反向TP引物，TP荧光探针，无核酸酶的蒸馏水，HBV阴性对照，HBV阳性对照，TP阴性对照，TP阳性对照；阳性工作标准品分别为含有HBV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HBV质粒，含有TP正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-TP质粒。上述的HBV和TP的引物、荧光探针与阳性工作标准品序列如下：HBV：正向HBV引物：TCCTGGCTATCGCTGGATGT反向HBV引物：AGGCATAGCAGCAGGATGAAGHBV荧光探针序列：FAM+CTGCGGCGTTTTATCATATTCC+TAMRAHBV扩增片段长度为66bp；HBV阳性工作标准品的目的序列为：TggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaacttgtcctggctatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggaacatcaactaccagcacgggaccatgcagaacctgcacgattcctgctcaHBV阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp；TP：正向TP引物：ATCCGGCATATGTCCAAGCT反向TP引物：TGTGAGCGTCTCATCATTCCATP荧光探针序列：FAM+TCATGCACCAGCTTCGACGTCT+TAMRATP扩增片段长度为65bpTP阳性工作标准品的目的序列为：gtgtacatgtgcacgtagcactaatgtcgagactgaaaaggagtgcacagaacagcatggggtatctgcatctgctgtgcaggatccggcatatgtccaagctgtcatgcaccagcttcgacgtctttggaatgatgagacgctcacacttgttatgcataatggaaagtttgattatcacgttatgcatcgtgcaggcgtttttgagcactgtgcatgtaatattttcgatacgatggtTP阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp。