[发明专利]供体角膜HBV和TP的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种供体角膜HBV和TP的荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒由DNA提取试剂、DNA扩增试剂和阳性工作标准品组成；其中DNA提取试剂为硅胶膜通用型DNA小提试剂盒；DNA扩增试剂包括2.5X PCR预混试剂，20X荧光探针增强剂，正向及反向HBV引物，HBV荧光探针，正向及反向TP引物，TP荧光探针，无核酸酶的蒸馏水，HBV阴性对照，HBV阳性对照，TP阴性对照，TP阳性对照；阳性工作标准品分别为含有HBV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HBV质粒，含有TP正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-TP质粒。上述的HBV和TP的引物、荧光探针与阳性工作标准品序列如下：

HBV：

正向HBV引物：TCCTGGCTATCGCTGGATGT

反向HBV引物：AGGCATAGCAGCAGGATGAAG

HBV荧光探针序列：FAM+CTGCGGCGTTTTATCATATTCC+TAMRA

HBV扩增片段长度为66bp；

HBV阳性工作标准品的目的序列为：

Tggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaacttgtcctggctatcgctgg

atgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaa

ggtatgttgcccgtttgtcctctacttccaggaacatcaactaccagcacgggaccatgcagaacctgcacgatt

cctgctca

HBV阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp；

TP：

正向TP引物：ATCCGGCATATGTCCAAGCT

反向TP引物：TGTGAGCGTCTCATCATTCCA

TP荧光探针序列：FAM+TCATGCACCAGCTTCGACGTCT+TAMRA

TP扩增片段长度为65bp

TP阳性工作标准品的目的序列为：

gtgtacatgtgcacgtagcactaatgtcgagactgaaaaggagtgcacagaacagcatggggtatctgcatctg

ctgtgcaggatccggcatatgtccaagctgtcatgcaccagcttcgacgtctttggaatgatgagacgctcacac

ttgttatgcataatggaaagtttgattatcacgttatgcatcgtgcaggcgtttttgagcactgtgcatgtaatattttc

gatacgatggt

TP阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp。

2.权利要求1的检测试剂盒应用于临床眼库供体少量结膜组织标本中的HBV和TP的检测。

3.检测试剂盒对眼库供体HBV和TP DNA进行检测的方法：

(1)供体眼球结膜组织DNA的提取和阳性工作标准品的构建：取供体眼球的结膜组织块5mg，放入离心管中，应用DNA提取试剂提取组织DNA作为DNA模板，用于下面的扩增反应；

(2)HBV或TP DNA的扩增：

在两组反应管中分别加入下列组分：

2.5X PCR预混试剂：                      8μL

正向HBV或TP引物(5pmol/μL)：            1μL

反向HBV或TP引物(5pmol/μL)：            1μL

HBV或TP荧光探针(5pmol/μL)：            0.5μL

20X荧光探针增强剂：                     1μL

DNA模板：                               5pg-50ng

无核酸酶的蒸馏水：                      至20μL

其中HBV组DNA模板为10⁸-10¹拷贝/μL倍比稀释的HBV阳性工作标准品和从供体眼球的结膜组织提取的DNA；TP组DNA模板为10⁸-10¹拷贝/μL倍比稀释的TP阳性工作标准品和从供体眼球的结膜组织提取的DNA，每个模板设立三个复孔，混匀离心后进行扩增反应，具体程序如下：

当供体眼球的结膜组织的DNA与阳性工作标准品同时进行反应后，制作出标准曲线，再将供体眼球的结膜组织的DNA扩增曲线得到的Ct值代入标准曲线，就可以得到供体眼球的结膜组织的HBV或TP DNA的拷贝数，从而确定供体角膜组织内是否感染致病病原体HBV或TP及其数量。