[发明专利]乙肝病毒L基因的玉米表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体及其应用。该玉米表达载体的构建方法是：(1)根据乙肝病毒L基因的编码序列设计1对引物P1和P2；(2)用引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增乙肝病毒L基因；(3)pCRG-L载体的构建；(4)重组载体pCAMG-L的构建，并转化农杆菌。本发明选择具有驱动外源性基因在组织或器官表达特异性和高水平表达的双重优势的玉米种子特异性启动子Globulin-1，构建了由玉米种子特异表达启动子Globulin-1调控的结核优势乙肝病毒L基因，使其特异、高效地在玉米种子中表达。本发明乙肝病毒L基因的玉米表达载体可用于制备疫苗。

主权项

一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)根据乙肝病毒L基因的编码序列设计1对引物：上游引物序列为：P1 5’-TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3’，含BamH I酶切位点和起始密码子；下游引物序列为：P2 5’-CGCGCTGCTAGCTCAAATGTATACCCAAAG-3’，含Nhe I酶切位点和终止密码子；(2)将乙肝表面抗原阳性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法获得DNA提取液，作为L基因扩增模板，用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应，扩增出乙肝病毒L基因；(3)pCRG-L载体的构建：用BamH I和Nhe I双酶切步骤(2)所得乙肝病毒L基因，用BamH I和Xba I双酶切pCR-G载体，将上述酶切纯化的产物按照摩尔比3∶1混合、连接、转化获得重组质粒pCRG-L；(4)重组载体pCAMG-L的克隆与构建：以重组载体pCRG-L为模板，设计引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应扩增得到Globulin-L基因，分离纯化后用HindIII和Nhe I双酶切，同时用HindIII和Xba I双酶切植物表达载体pCAMBIA1300，再将上述酶切产物进行同尾酶连接，转化，获得重组载体pCAMG-L；引物P3的序列为：P3：5’-TTAATCGAAGCTTGCCGAGTGCCATCCT-3’，含HindIII酶切位点；引物P4的序列为：5’-CGCGCTGCTAGCTCAAATGTATACCCAAAG-3’，含Nhe I酶切位点。