[发明专利]乙肝病毒L基因的玉米表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体及其应用。

背景技术

乙型肝炎病毒((Hepatitis B virus HBV)的感染是一个非常严重的全球性的健康问题。目前全球60亿人口中有20亿人感染过乙型肝炎病毒，占全球人口三分之一。约25％的人最终将转化为慢性肝病，包括肝硬化和肝癌。控制乙肝传播的主要手段是接种有效的疫苗进行预防和阻断传播途径，。目前应用的乙肝疫苗主要由中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和啤酒酵母表达的乙肝病毒表面抗原HBsAg(S蛋白)颗粒组成。在预防接种的过程中发现仍有10％～20％人群接种乙肝疫苗表现为无反应或弱反应，甚至根本不产生抗体。随着年龄的上升，无反应或弱反应者增多，尤其是在艾滋病感染者、肾透析和免疫抑制病人中这种低反应或不反应的发生率会更高。另外，由于长期推广乙肝疫苗后，HBVS基因变异株以弱势准种形式广泛存在，有可能在免疫后人群中流行而成为新的公共问题。因此，研制新型免疫原性更好的乙肝疫苗是国内学者迫切需要解决的课题。

研究表明，乙肝病毒全包膜蛋白L(包含Pre1、Pre2、S基因编码蛋白)，其中preS1肽段含有好几个免疫原性比S蛋白更强的T细胞和B细胞表位，由preS1引起的细胞特异性的细胞免疫应答可以帮助克服某些人对S蛋白的免疫无反应状态或同时对preS1和preS2蛋白双重无反应状态；preS2中也含有多个抗原表位和病毒中和位点，在疫苗制剂中加入preS1和preS2的抗原表位后，人群对传统的乙肝疫苗的不反映和低反应频率大大降低，抗体产生的时间较仅有S区抗原的时间提前；因而含有乙肝病毒preS1和preS2抗原成分或HBV S基因变异株核心蛋白成分的各种新型重组乙肝疫苗具有更强的免疫原性，能诱导更高效的免疫应答，产生中和乙肝病毒抗体，保护机体免受病毒攻击，并可打破免疫耐受，清除乙肝病毒。

转基因植物疫苗是将植物分子生物学技术与机体免疫机理相结合，使外源基因在植物中表达，免疫人体后获得特异性抗体的新型疫苗，和其他疫苗相比有安全、高效、廉价、易运输、易推广等优点。但外源基因在植物中低表达是研究人员面临的重大难题之一，开发并建立高效表达体系和高效植物表达载体的研究是克服该问题的重要途径。理论上，用于生产口服疫苗的植物反应器要需符合以下条件：①表达蛋白的含量较高，至少能占可溶性总蛋白0.01-0.1％；②抗原蛋白的浓度要稳定、一致，以便定量口服；③常温下长期保存，并保证抗原蛋白生物活性稳定；④转基因植物表达抗原蛋白的组织要可口、服用方便；⑤种植技术普及，人人可种植。

玉米作为植物反应器候选之一，具有其独特的优势：①表达外源性蛋白的玉米种子在常温下至少保存一年；②抗原蛋白浓度稳定；③检测到在转基因玉米中表达的LT-B蛋白占可溶性总蛋白0.05％～0.1％之间，有的达到1.8％。Jeffrey和Stephen等在对外源性基因Lt-B表达进行定位，发现其编码的蛋白被定位到液泡当中蛋白表达量最高，其次是在细胞表面，再次是在内质网中，而定位到细胞核或质体当中，或者不进行定位时蛋白表达量最低。相反，Lt-B基因在烟叶中或马铃薯茎中表达时，定位在内质网的蛋白质表达量可达到在细胞表面的三到四倍；④玉米是全世界三大主食之一，广受人们的喜爱。正因为玉米具备多项优势，已经成功表达外源性基因，并取得较好的效果。1986年Fromm等首次在玉米中成功表达除草剂pat基因，经过约十年深入研究，1995年后转基因玉米已经进入商业化阶段。其中，抗虫(Bt)转基因玉米和除草剂已经被批准商业化。到了2005年，全球转基因玉米种植面积超过2120万hm2，转基因玉米市场价值达到19.1亿美元。当然，玉米真正成为人类防治传染病的口服疫苗，还需要进一步探索。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种包含乙肝病毒L基因的玉米表达载体的构建方法；所构建的pCAMG-L，是一个包含1201个碱基对的闭环质粒。将表达乙肝包膜大蛋白(L蛋白)的全基因插入到植物表达载体pAMBIA1300中。

本发明的另一目的在于提供上述方法构建的玉米表达载体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种包含了乙肝病毒L基因的玉米表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)根据乙肝病毒L基因的编码序列设计1对引物：

上游引物序列为：P1 5’-TTATCG GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTC-3’，含BamH I酶切位点和起始密码子；