[发明专利]大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法

摘要

本发明提供一种大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法，根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引物，预期扩增167bp片段：上游引物PF：5’-GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC-3’，下游引物PR：5’-GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC-3’；同时合成探针PB：5’-(FAM)ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG(Ecl ipse)-3’用以荧光检测。再经提取模板DNA、PCR扩增反应，根据检测到的CT值判断样品中的病毒粒子含量，具有检测速度快、检测精度高的优点。

主权项

一种大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：(一)、引物的设计根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引物和探针如下：上游引物PF：5’ GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC 3’下游引物PR：5’ GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC 3’探针PB：5’ (FAM)ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG(Eclipse) 3’预期扩增DNA片段167bp；(二)、提取模板DNA(1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动；(2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液；(3)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟；(4)、用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μl TE溶解DNA，4℃贮存备用；(三)、PCR反应体系ddH2O 18.8μL10×PCR Buffer 2.5μL4×dNTP(10mmol/L) 0.5μLTaq酶(5U/μL) 0.2μLPF(10μmol/L) 0.5μLPR(10μmol/L) 0.5μLROX染料 0.5μLPB(10μmol/L) 0.5μL模板DNA 1.0μL检测待测样品的同时，按108、107、106、105、104拷贝数/μL系列稀释的线性化质粒pMT rt，各取1μL作为模板，检测CT值，制作标准曲线，另以1μL ddH2O为模板作阴性对照，PCR结束后，根据检测到的CT值判断样品中的病毒粒子含量；(四)、PCR反应条件95℃预变性3分钟；再40个循环反应，包括95℃变性15秒，60℃退火和延伸共1分钟；(五)、判断标准当CT值小于等于33可判断为阳性；当CT值大于等于35判断为阴性；当CT值在33 35之间为可疑，需重复检测，如果重复检测CT值小于等于33可判断为阳性，大于33可判断为阴性。