[发明专利]大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及对大口黑鲈溃疡综合症虹彩病毒特异的检测方法。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)，又名加州鲈，具有生长快、病害少、耐低温、肉质鲜美和容易起捕等特点，从上世纪七十年代开始推广到世界各地，目前全国大口黑鲈的年产量在10万吨左右。自从2006年以后，每年6-10月期间，一种溃疡综合症在广东省的养殖大口黑鲈中流行，而且有逐年加重的趋势。感染该病毒的鱼发病时皮肤和肌肉溃烂，脾脏和肾脏变大，病鱼死亡率最高达60％，给养殖者造成了巨大的损失，已对大口黑鲈养殖产业构成了严重威胁。2008年，本单位的科研人员从病鱼中成功分离到一种病毒，经回归感染确认该病毒就是导致溃疡病的病原，经过电镜观察和DNA序列分析，确定了该病毒的分类地位是虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)，命名为大口黑鲈溃疡综合症病毒。由于该病毒是新发现的病毒，对这种病毒病还没有有效的治疗方法，所以对该病的早期快速诊断，确定病原成为重要的防治手段，以减少生产上的损失。

水生病毒检测方法有生物学测定法、凝集试验、透射电镜观察法、酶联免疫反应、免疫组织化学、PCR检测等方法。生物学方法比较灵敏，但要花费2-3周的时间，不适合作病毒的快速检测与鉴定；凝集试验快速简便，但敏感性较差，应用不广；透射电镜观察法需要透射电镜设备，费时、费力，成本很高；酶联免疫反应检测快速，但需要有效的特异的抗体；免疫组织化学耗时，步骤繁琐，也需要有特异的抗体；PCR检测法具有特异、敏感、高效、快速、简便、重复性好和易自动化操作等突出的优点，已广泛应用于致病病毒的检测；荧光定量PCR方法是在PCR方法基础上进行改进了的又一种病毒检测方法，其优点在于灵敏度比普通PCR方法更高，且省去了电泳的步骤，节省了时间，提高了检测的效率。大口黑鲈溃疡综合症病毒是新近发现、分离并鉴定的病毒，在分类地位上属于虹彩病毒科蛙病毒属，我们克隆并确定了该病毒的DNA甲基转移酶基因及其两端侧翼碱基序列，GenBank登陆号为GU256634。1999年，Mao等人根据脊椎动物虹彩病毒主要依壳蛋白基因和DNA甲基转移酶基因的保守序列设计并合成引物，利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法有效地鉴定出虹彩病毒科蛙病毒属的病毒，但利用这个方法不能将大口黑鲈溃疡综合症病毒与蛙病毒属的其它病毒株进行区分。

发明内容

本发明的目的正是针对现有技术存在的技术缺陷，根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶基因3’端序列设计特异性PCR扩增引物，建立一种快速、准确、灵敏的在鱼发病早期特异性检测大口黑鲈溃疡综合症病毒的荧光实时定量PCR方法，其与普通PCR方法相比，虽然对设备要求较高、检测成本也较高，但该方法具有灵敏度更高、更加直观、更加省时省力的优点。

为达到上述目的，本发明大口黑鲈溃疡综合症病毒荧光实时定量PCR检测方法的检测步骤如下：

(一)、引物的设计

根据大口黑鲈溃疡综合症病毒DNA甲基转移酶3’端非编码区序列，设计并合成引物和探针如下：

上游引物PF：5’-GCTCGTTCGGTTGTGCTGAC-3’

下游引物PR：5’-GTGTCTCCCTGGTAGTCTTTCAAAC-3’

探针PB：5’-(FAM)ATCTGTGTAACCGCCCGCCGCAAAG(Eclipse)-3’

预期扩增DNA片段167bp；

(二)、提取模板DNA

(1)、取待检测鱼的脾脏组织50mg剪碎后，加入0.5mL的裂解液，55℃消化1小时，其间不时轻轻摇动。

(2)、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用氯仿抽提一次，室温下静置5分钟后，12000转/分钟离心10分钟，取上清液。

(3)、加入2倍体积的无水乙醇，室温静置10分钟沉淀DNA，12000转/分钟离心10分钟。

(4)、用70％乙醇洗涤1次，12000转/分钟离心2分钟，吸去上清，室温静置干燥10分钟，加入50μ1TE溶解DNA，4℃贮存备用。

(三)、PCR反应体系

ddH₂O                18.8μL

10×PCR Buffer       2.5μL

4×dNTP(10mmol/L)    0.5μL