[发明专利]一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法

摘要

本发明公开了一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法。根据大肠埃希氏菌DNA目标序列设计了捕获探针DNA₁和识别探针DNA₂，捕获探针DNA₁固定标记在玻璃片上；识别探针DNA₂联接长寿命发光稀土铕配合物。当DNA₁与DNA₂串联时能够与目标DNA(即待测生物的DNA)发生碱基互补的杂交反应；构建了基于普通玻片表面两探针串联的DNA检测模型。将长寿命发光的稀土铕配合物作为识别探针DNA₂的标记物，利用时间分辨荧光的方法能有效消除生物体系内源荧光和固体基质背景光的干扰。本发明检测方法用时短，反应结果直观、灵敏、准确，具有十分显著的优点。

主权项

1.一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法，其特征在于，A、捕获探针DNA1的固定先将玻片醛基化，再将碱基序列为5’-ACA TTG ACG CAG GTG ATC GGA CGTTTTTTTTTT-3’-NH2的捕获探针DNA1配成使用浓度5μg/mL，取40μLDNA1滴加到己醛基化的玻片表面，室温反应3h；最后洗涤并封闭剩余的醛基；B、稀土铕配合物标记识别探针DNA2(1)将2mg稀土铕配合物Eu(TTA)3(NH2-phen)分散到5mL 2.5％戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的Eu(TTA)3phen颗粒重新悬于4mL pH为7.2的PBS缓冲液中；(2)再将碱基序列为NH2-5’-TTTTTTTTTT GTA TCG GTG TGA GCG TCG CAG AA-3’的识别探针DNA2配成使用浓度15μg/mL，加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中，30℃下于震荡培养箱中反应5h，反应完成后离心洗涤；再分散于2mL PBS缓冲液中备用；C、提取大肠埃希氏菌DNAD、杂交(1)在杂交反应前，将提取的大肠埃希氏菌基因组DNA通过高温解链使其变性成为单链；(2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA2与提取的待测单链DNA在固定了DNA1的玻片上杂交10h；杂交体系为：10μL提取的变性单链DNA溶液，10μL标记了稀土铕配合物的DNA2溶液，10μL12×SSC溶液；保持杂交温度为43℃；(3)杂交后，将玻片依次在以下三种洗涤液中清洗，洗涤液I 1×SSC/0.03％SDS、洗液II 0.2×SSC和洗液III 0.05×SSC，洗涤时间均为2min，洗涤温度为43℃；E、杂交后信号检测杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA2、捕获DNA1和提取的待测单链DNA探针形成的杂交体，在激光激发下产生一个光信号，检测出玻片上的稀土长寿命发光配合物的光信号，激发和发射狭缝分别为8.0nm，延迟时间0.1ms，门时间1.0ms；根据检测的光信号检测样品中是否存在大肠埃希氏菌DNA。