[发明专利]一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法

权利要求书

1.一种基于时间分辨荧光法和DNA杂交的大肠埃希氏菌检测方法，其特征在于，

A、捕获探针DNA1的固定

先将玻片醛基化，再将碱基序列为5’-ACA TTG ACG CAG GTG ATC GGA CGTTTTTTTTTT-3’-NH2的捕获探针DNA1配成使用浓度5μg/mL，取40μLDNA1滴加到己醛基化的玻片表面，室温反应3h；最后洗涤并封闭剩余的醛基；

B、稀土铕配合物标记识别探针DNA2

(1)将2mg稀土铕配合物Eu(TTA)3(NH2-phen)分散到5mL 2.5％戊二醛溶液中，室温下剧烈震荡5h，离心后用二次蒸馏水洗3次，得到醛基修饰的Eu(TTA)3phen颗粒重新悬于4mL pH为7.2的PBS缓冲液中；

(2)再将碱基序列为NH2-5’-TTTTTTTTTT GTA TCG GTG TGA GCG TCG CAG AA-3’的识别探针DNA2配成使用浓度15μg/mL，加入到稀土铕配合物颗粒悬浮的PBS溶液中，30℃下于震荡培养箱中反应5h，反应完成后离心洗涤；再分散于2mL PBS缓冲液中备用；

C、提取大肠埃希氏菌DNA

D、杂交

(1)在杂交反应前，将提取的大肠埃希氏菌基因组DNA通过高温解链使其变性成为单链；

(2)将标记上稀土铕配合物的识别探针DNA2与提取的待测单链DNA在固定了DNA1的玻片上杂交10h；杂交体系为：10μL提取的变性单链DNA溶液，10μL标记了稀土铕配合物的DNA2溶液，10μL12×SSC溶液；保持杂交温度为43℃；

(3)杂交后，将玻片依次在以下三种洗涤液中清洗，洗涤液I 1×SSC/0.03％SDS、洗液II 0.2×SSC和洗液III 0.05×SSC，洗涤时间均为2min，洗涤温度为43℃；

E、杂交后信号检测

杂交清洗后带有稀土铕配合物标记的识别DNA2、捕获DNA1和提取的待测单链DNA探针形成的杂交体，在激光激发下产生一个光信号，检测出玻片上的稀土长寿命发光配合物的光信号，激发和发射狭缝分别为8.0nm，延迟时间0.1ms，门时间1.0ms；根据检测的光信号检测样品中是否存在大肠埃希氏菌DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的A步中洗涤和封闭剩余的醛基过程如下：

(1)用0.2％的SDS洗涤2次玻片，二次蒸馏水洗涤2次，室温晾干；

(2)将0.1M甘氨酸封闭玻片上剩余的醛基，作用时间为1h；

(3)0.2％的SDS洗涤2次玻片，二次蒸馏水洗涤2次，室温晾干备用。