[发明专利]一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法

摘要

本发明公开了一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法，属于生物技术与组织工程领域。用同一份脐带血的血清代替胎牛血清、不添加细胞因子及无基质细胞支持，采用微载体与生物反应器相结合的策略，实现脐带血来源造血干细胞与间充质干细胞的共培养。本发明能够支持UCB-HSCs、UCB-MSCs在三维条件下良好扩增，完全替代胎牛血清的作用，还能避免异体间的免疫排斥反应；cytodex-3微载体能够为贴壁生长特性的UCB-MSCs提供黏附表面，使UCB-MSCs在在三维动态环境中实现贴壁悬浮培养成为可能；采用自然沉降的方法，将悬浮的UCB-HSCs和黏附在微载体上的UCB-MSCs两种干细胞分离并收获。

主权项

1.一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法，其特征在于以下步骤：(1)分离人脐带血单核细胞：脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次脐带血采集量平均为50～100mL；脐带血采集后，按体积比1∶1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为1.077g.mL-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm、25分钟密度梯度离心后获得单核细胞，Ficoll细胞分离液与脐带血的体积比为1∶1～1∶2；分离后的细胞用IMDM基础培养基1000rpm、5分钟离心洗涤两次，调整细胞密度备用；(2)获得同一份脐带血血清：脐带血采集后，按体积比1∶1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为1.077g.mL-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm、25分钟密度梯度离心后，收获单核细胞；然后用滴管吸取第一层血清液，置入无菌离心管中备用；(3)cytodex-3微载体的预处理：将干燥的cytodex-3微载体置于硅化处理的玻璃瓶中，并用不含Ca2+、Mg2+离子的PBS缓冲盐溶液在室温下浸泡4小时以上，偶尔搅拌；用新的不含Ca2+、Mg2+离子的PBS缓冲盐溶液冲洗两次后，高压灭菌备用；(4)共培养UCB-HSCs与UCB-MSCs：将分离得到的UCB-MNCs以2×106cells.mL-1的密度接种到提前铺满cytodex-3微载体的24孔板中，添加20％的脐带血血清；采用自然沉降的方法将悬浮的UCB-HSCs和粘附在GCSC微载体上的UCB-MSCs分离并收获。