[发明专利]一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与组织工程领域，涉及到一种使用同一份脐带血的血清来收获干细胞的方法，特别涉及到一种使用同一份脐带血的血清来同时获得脐带血造血干细胞与间充质干细胞的方法。

技术背景

造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)可以广泛应用于基因治疗、肿瘤净化和骨髓移植等方面(Bellantuono I.The International Journal of Biochemstry&CellBiology，2004，36(4)：607-620)，尤其是造血干细胞移植已成为癌症患者放化疗后造血功能重建的常规方法，但细胞数量有限极大地限制了其在临床上的应用。解决此问题的有效方法是实施HSCs的体外大规模扩增。尽管造血干细胞移植能够显著地改善癌症患者放化疗之后的生命质量，但绝大多数患者不可避免的要承受短期内的严重嗜中性粒细胞减少症和血小板减少症的痛苦，因此有必要提出新的治疗方案来降低这些并发症的发生。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)已被证明在体外具有支持造血发生的功能，同时在NOD/SCID小鼠体内实验中，也证明了同时移植HSCs和MSCs加速了小鼠造血功能的重建(Kim D H，et al.Journal of Korean Medical Science，2006，21(6)：1000-1004)。而对于临床上乳腺癌患者化疗后的造血干细胞移植，联合移植入自体的MSCs同样具有促进造血重建的功能，同时降低了伴随造血干细胞移植并发症的发病率。另外，MSCs也可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞。因此，能够在同一个培养体系内同时培养与收获HSCs和MSCs两种干细胞，具有重要的临床应用价值。

脐带血(Umbilical cord blood，UCB)作为HSCs的来源之一，同时含有MSCs。相对于骨髓及外周血，脐血造血干细胞(CBSC)具有富含更早期的造血干/祖细胞、免疫原性弱、对异源性抗原产生的抗体少、成熟性T细胞较少、采集和保存容易、无肿瘤细胞污染、对供者无损伤及副作用、CD34⁺CD38^-与CD34⁺CD33^-的比例较高、在移植过程中可以减少移植物抗宿主病(GVHD)发生率、来源广泛等一系列优点，使得与脐带血有关的造血干/祖细胞研究成为热点。

然而HSCs和MSCs分别具有悬浮生长和贴壁生长的生物学特性，体外必须同时提供悬浮培养环境与动态贴附表面，才有可能在模拟体内微环境的条件下实现HSCs和MSCs的共培养。微载体与适宜生物反应器相结合是解决此问题的可行方法。变性胶原包被的交联葡聚糖(cytodex-3)微载体以其良好的表面贴附特性，在贴壁细胞三维动态培养方面倍受关注。

另外，相对于普遍应用的胎牛血清，使用同一份脐带血中的自体血清可以为细胞提供更好的营养物质，同时，在细胞以后的临床应用中，也可以避免胎牛血清带来的免疫反应。

因此，用同一份脐带血的血清代替胎牛血清、不添加细胞因子及无基质细胞支持，采用微载体与生物反应器相结合的策略，实现脐带血来源造血干细胞与间充质干细胞的共培养。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种同时培养出脐带血造血干细胞与间充质干细胞的方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1、分离人脐带血单核细胞：脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次脐带血采集量平均为50～100mL。脐带血采集后，按体积比1∶1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为1.077g.mL^-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm，25分钟密度梯度离心后获得单核细胞(Mononuclear cells，MNCs)，Ficoll细胞分离液与脐带血的体积比为1∶1～1∶2。分离后的细胞用IMDM基础培养基离心洗涤两次(1000rpm，5分钟)，调整细胞密度备用。

2、获得同一份脐带血血清：本专利所使用的人自体血清为与细胞同一来源的脐带血血清，其获得方法为：脐带血采集后，按体积比1∶1与PBS缓冲盐溶液混合均匀，用密度为1.077g.mL^-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm、25分钟密度梯度离心，收获单核细胞；然后用滴管吸取第一层血清液，置入无菌离心管中备用。