[发明专利]一种高通量筛选β-葡聚糖酶热稳定性提高突变体的方法

摘要

高通量筛选是一种同时分析多个样本的方式，从大量样本中挑选出符合目标的个体，目前广泛应用于药物开发、酶的发现和改造方面。体外定向进化作为后基因组时代一个重要的技术平台正得到日益广泛的应用。定向进化技术在改造酶的热稳定性方面已表现出一定的优越性，而将这一技术应用在β-葡聚糖酶热稳定性定向进化上国内外尚未有相关报道。采用定向进化技术对β-葡聚糖酶的热稳定性改造过程中，如何快速有效地筛选得到目标突变体是其瓶颈问题之一。本发明建立了基于酶标仪、96微孔板和环境压力的热稳定性提高突变体高通量筛选模型，见附图1。该发明将96微孔板菌落的诱导表达与菌落的原位复制技术有机结合起来，以β-葡聚糖酶与蓝色葡聚糖底物作用后释放蓝色基团特性为基础，以各孔酶反应液的吸光值大小为指标建立了直观、快速简易的高通量筛选方法。通过该方法可以筛选到热稳定性和催化活性同时提高的变异体且稳定性良好。对该方法的筛选稳定性考察结果显示，其精密度良好，RSD为8.1％，重现性达到100％，假阳性率及假阴性较低，分别为6.25％及2.1％。

主权项

一种高通量筛选β‑葡聚糖酶热稳定性突变体的方法，其特征是方法步骤为：1.突变体库的复制1.1从平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有1000μL LB培养基(内含30μg/mL卡那霉素)的96深孔板中，每孔对应一特定转化子。每块深孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照。37℃，200r/min振摇培养12h。1.2在无菌条件下，从96深孔板中取出20μL菌液，对应接入含1000uL新鲜LB培养基的另一96深孔板中，并进行37℃，200r/min振摇培养。4℃临时冷藏种子96深孔板。2.文库的诱导表达2.137℃，200r/min振摇培养重组菌4h后，每孔加入2g/L IPTG 40μL以及180g/L乳糖100μL，混匀后于24℃，200r/min振摇培养6h。在酶标仪上测定OD600并保存数据后于3000r/min，4℃，离心20min。2.2以每孔一一对应为原则，利用排枪快速移取20μL上清粗酶液至两块96PCR反应板中。3.文库上清粗酶液的高温热钝化3.1将其中一块含有粗酶液的96PCR反应板经过80℃金属浴处理0.5h，另一对应板4℃冷藏。4.文库的酶活表征4.1将两快96PCR反应板40℃预热10min后(利用酶标仪加热模块)，每孔中加入40℃蓝色葡聚糖底物(使用前和pH6.5的20mmol/L的磷酸缓冲液1∶19混合)80μL，混匀后40℃反应10min。每孔中加入300μLl沉淀液，利用低温离心机，于3000r/min，4℃，离心20min，利用排枪移上清至两块96反应板中并测定OD590吸光值。4.2利用酶标仪软件计算每个克隆(OD590，未钝化‑OD590，热钝化)/OD600的数值，以阳性对照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行斜面保藏。4.3粗筛阳性突变体用于下一轮复筛。