[发明专利]一种高通量筛选β-葡聚糖酶热稳定性提高突变体的方法

权利要求书

1.一种高通量筛选β-葡聚糖酶热稳定性突变体的方法，其特征是方法步骤为：

1.突变体库的复制

1.1从平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有1000μL LB培养基(内含30μg/mL卡那霉素)的96深孔板中，每孔对应一特定转化子。每块深孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照。37℃，200r/min振摇培养12h。

1.2在无菌条件下，从96深孔板中取出20μL菌液，对应接入含1000uL新鲜LB培养基的另一96深孔板中，并进行37℃，200r/min振摇培养。4℃临时冷藏种子96深孔板。

2.文库的诱导表达

2.137℃，200r/min振摇培养重组菌4h后，每孔加入2g/L IPTG 40μL以及180g/L乳糖100μL，混匀后于24℃，200r/min振摇培养6h。在酶标仪上测定OD₆₀₀并保存数据后于3000r/min，4℃，离心20min。

2.2以每孔一一对应为原则，利用排枪快速移取20μL上清粗酶液至两块96PCR反应板中。

3.文库上清粗酶液的高温热钝化

3.1将其中一块含有粗酶液的96PCR反应板经过80℃金属浴处理0.5h，另一对应板4℃冷藏。

4.文库的酶活表征

4.1将两快96PCR反应板40℃预热10min后(利用酶标仪加热模块)，每孔中加入40℃蓝色葡聚糖底物(使用前和pH6.5的20mmol/L的磷酸缓冲液1∶19混合)80μL，混匀后40℃反应10min。每孔中加入300μLl沉淀液，利用低温离心机，于3000r/min，4℃，离心20min，利用排枪移上清至两块96反应板中并测定OD₅₉₀吸光值。

4.2利用酶标仪软件计算每个克隆(OD_{590，未钝化}-OD_{590，热钝化})/OD₆₀₀的数值，以阳性对照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行斜面保藏。

4.3粗筛阳性突变体用于下一轮复筛。