[发明专利]一种豇豆重花叶病毒的分子检测方法

摘要

本发明涉及豇豆重花叶病毒的分子检测方法，属于生物技术领域。该方法包括如下步骤：获得病毒粗提液；制备免疫捕获PCR管；释放免疫捕获PCR管中的豇豆重花叶病毒RNA并以其为模板，以序列为：5’-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3’的CPSMVR为引物进行反转录反应，得到反转录产物；以反转录产物为模板，正向引物5’-GGTCAATCCCGGCATTATTG-3’，反向引物CPSMVR，Taq Man探针CPSMVPro 5’FAM-TGTAGCACAATCAGGGCAAACACAGCA-TAMRA 3’，进行实时荧光PCR反应；初始循环数≤35，表示样品感染了豇豆重花叶病毒。

主权项

一种豇豆重花叶病毒的分子检测方法，具体步骤如下：(1)样品病毒粗提液的制备：向待检样品中加入抽提缓冲液，经研磨及离心，取上清液，即为病毒粗提液；(2)免疫捕获PCR管的制备：取稀释后的豇豆重花叶病毒包被抗体加入PCR管中孵育，用洗涤缓冲液洗涤后，加入步骤1所述的病毒粗提液，4℃冰箱孵育过夜，洗涤后风干，即获得免疫捕获PCR管；(3)免疫捕获PCR管中豇豆重花叶病毒RNA释放及反转录：释放步骤(2)所述免疫捕获PCR管中的豇豆重花叶病毒RNA并以其为模板，以序列为：5’-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3’的CPSMVR为引物进行反转录反应，得到反转录产物；(4)实时荧光PCR反应：以步骤(3)所得反转录产物为模板，正向引物CPSMVF序列：5’-GGTCAATCCCGGCATTATTG-3’，反向引物CPSMVR的序列：5’-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3’，Taq Man探针CPSMVPro的序列：5’FAM-TGTAGCACAATCAGGGCAAACACAGCA-TAMRA 3’，进行实时荧光PCR反应；(5)结果分析：步骤4所述的实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR仪分析软件，对扩增的图谱进行分析，当初始循环数(CT)≤35时，判定实时荧光PCR反应为阳性，表示所检测的病毒样品为豇豆重花叶病毒。