[发明专利]一种豇豆重花叶病毒的分子检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种豇豆重花叶病毒的检测方法，特别涉及免疫捕获-反转录- 实时荧光PCR分子检测方法(或称IC-RT-Real time PCR法)，属于生物技术领 域。

背景技术

豇豆重花叶病毒(Cowpea severe mosaic virus，CPSMV)属于豇豆花叶病 毒科(Comoviridae)豇豆花叶病毒属(Comovirus)的确定种。该病毒的自然寄 主为豆科植物，可严重侵染豇豆、大豆等多种作物。该病毒侵染豇豆后，可造成 叶片花叶和斑驳，严重的可导致整株枯死；在田间对豇豆的侵染率可达100％， 造成产量损失可达50％。

目前CPSMV主要分布在美洲地区，如美国、巴西、秘鲁、委内瑞拉、特立尼 达、波多黎各、哥斯达黎加和苏里南等国，中国尚无发生与危害的报道。

CPSMV可通过种子进行远距离传播，其中豇豆的种传率为10％，长豇豆(Vigna sesquipedalis)的种传率为8％；在田间，该病毒还可以通过菜豆叶甲(Ceratoma trifurcata)，带斑黄瓜叶甲(Diabrotica balteata)和南美叶甲(D.speciosa)等媒 介昆虫及机械传播。该病毒的自然寄主在中国广泛种植，且气候条件与该病毒发 生地的气候条件相似，因此，CPSMV传入、定殖和扩散的可能性都很大，并可随 种子的调运和害虫在国内传播。CPSMV已成为我国豆科植物尤其是豇豆和大豆生 产潜在的巨大威胁。

鉴于该病毒的自然寄主豇豆和大豆等为中国的主要经济作物，能够对其造成 很大的危害，中国已将该病毒列入“中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名 录”。

目前，检疫口岸多利用传统的DAS-ELISA(双抗夹心酶联免疫吸附法)技 术来检测CPSMV，不够快速、灵敏、准确。

发明内容

本发明的目的是提供一种适宜于检疫口岸使用的豇豆重花叶病毒 IC-RT-Real time PCR分子检测方法，以便于快速、灵敏、准确地对口岸进口的 豇豆种子进行豇豆重花叶病毒的检测。

本发明提供一种豇豆重花叶病毒的分子检测方法，具体步骤如下：

(1)样品病毒粗提液的制备：向待检样品中加入抽提缓冲液，经研磨及离 心，取上清液，即为病毒粗提液；

(2)免疫捕获PCR管的制备：取稀释后的豇豆重花叶病毒包被抗体加入PCR 管中孵育，用洗涤缓冲液洗涤后，加入步骤1所述的病毒粗提液，4℃冰箱孵育过 夜，洗涤后风干，即获得免疫捕获PCR管；

(3)免疫捕获PCR管中豇豆重花叶病毒RNA释放及反转录：释放步骤(2)所 述免疫捕获PCR管中的豇豆重花叶病毒RNA并以其为模板，以序列为： 5’-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3’的CPSMVR为引物进行反转录反应，得到反转录产 物；

(4)实时荧光PCR反应：以步骤(3)所得反转录产物为模板，正向引物CPSMVF 序列：5’-GGTCAATCCCGGCATTATTG-3’，反向引物CPSMVR的序列： 5’-GGCTTCTGCAGGTGTTCCAA-3’，Taq Man探针CPSMVPro的序列： 5’FAM-TGTAGCACAATCAGGGCAAACACAGCA-TAMRA 3’，进行实时荧光PCR反应；

(5)结果分析：步骤4所述的实时荧光PCR反应结束后，利用实时荧光PCR 仪分析软件，对扩增的图谱进行分析，当初始循环数(C_T)≤35时，判定实时荧 光PCR反应为阳性，表示所检测的病毒样品为豇豆重花叶病毒。

步骤(3)所述免疫捕获PCR管中豇豆重花叶病毒RNA释放及反转录的具体过 程为：在所述免疫捕获PCR管中加入病毒RNA释放液，然后95℃处理5min，迅速 冷却后，再加入下列物质进行反转录：2μL的5×Buffer，0.5μL的RT Enzyme Mix I，反应程序为：42℃反应60min；所述病毒RNA释放液的组成为0.5μL的浓度为 10μmol/L的反向引物CPSMVR及7.0μL的无RNA酶的ddH₂O。