[发明专利]建立针对中国人口腔白色海绵状斑痣动物模型的实验方法

摘要

一种建立针对中国人口腔白色海绵状斑痣动物模型的实验方法，该实验方法的步骤为：探测中国人WSN患者的突变基因位点，K4突变基因重组质粒的构建，重组质粒转染，K4转基因动物模型的筛选与鉴定。本发明针对中国家系发现的WSN基因突变位点进行实验研究，具有一定的针对性，唯一性。该技术周期短，成本低，特异性强，可基本表现出WSN表征，有助于人们对WSN疾病发生机制进行实验研究。

主权项

一种建立针对中国人口腔白色海绵状斑痣动物模型的实验方法，其特征在于，该实验方法的步骤为：探测中国人WSN患者的突变基因位点(1)用盐析法提取WSN患者的DNA；(2)设计引物：K4F1 5’‑GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG‑3’，K4R1 5’‑GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC‑3’和K4F2 5’‑GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG‑3’，K4R2 5’‑GCCAAAGCCACTACTCAGGCC‑3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增K4基因上的目的基因；(3)对扩增的K4基因进行测序；(4)发现中国人WSN患者的基因突变位点；K4突变基因重组质粒的构建(1)利用STRATAGENE公司的点突变试剂盒在质粒pCMV6‑XL4‑KRT4的KRT4基因1829位上制造突变G变为A，使第520密码子由GAG突变为AAG，氨基酸由E突变为K，PCR及测序证明突变成功；(2)构建用于连接的linker：A‑‑MluI‑AvaI‑‑AvaI‑‑BamHI‑‑EcoRI‑‑HindIII‑A插入到T‑vector中，然后分别利用限制性内切酶BamH I(241bp)、EcoRI(816bp)、HindIII(2479bp)进行重组，产生重组的KRT4基因；将KRT4基因利用BamHI/HindIII插入表达载体pcDNA3.1(+/‑)，完成K4转基因模型重组质粒的构建；重组质粒转染将重组质粒转染至LA795鼠肺癌细胞中进行培养，发现转染野生型cytokeratin4cDNA重组质粒的细胞表现为长梭形，转染突变型的细胞则表现为不规则形或短梭形，说明基因突变影响了转染细胞中间张力丝的稳定性，从而引起细胞形态的改变；此表现证实该突变为中国人WSN病的致病突变基因；K4转基因动物模型的筛选与鉴定(1)用限制性内切酶PvuI将构建好的pcDNA3.1‑KRT4进行线性化，纯化后进行显微注射，将K4基因的重组质粒导入小鼠受精卵中(2)对转基因首建鼠用PCR法进行检测鉴定；(3)将鉴定阳性的首建转基因小鼠和非转基因小鼠合笼，繁殖得到F1代小鼠；(4)利用聚合酶链式反应鉴定F1代转基因小鼠；(5)将鉴定阳性的F1代转基因小鼠，通过光镜、电镜、Westernblotting、免疫组化、免疫荧光、原位杂交等方法，证实其蛋白和临床病理表型表现为白色海绵状斑痣的表现。