[发明专利]建立针对中国人口腔白色海绵状斑痣动物模型的实验方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种实验技术应用于研究人类口腔粘膜病——白色海绵状斑痣，将人类口腔疾病转移至动物模型上从而为该病的机制研究和治疗提供有效的实验动物的技术。

背景技术：

口腔白色海绵状斑痣(white sponge nevus以下简称WSN)又称白色折皱病，是角蛋白基因突变引起的一种常染色体显性遗传病，特性为具有不规则的外显性，个体发病率与家族系列相比较多，棘层细胞表达蛋白K13和K4的点突变或外源碱基的插入，导致此病的发生。目前关于白色海绵状斑痣的突变基因的研究，国际上共发现了9个突变位点(其中2个是我们发现的)，通过比较其他突变位点，我们发现该突变具有明显的特点，即存在显著的家族遗传性和人种特异性。2008年，通过研究，我们发现中国人的WSN病的致病基因突变发生在Keratin 4基因上，突变位点为1829G→A，蛋白质E520K，从而首次在国际上揭示了中国人此病的致病基因突变位点，但到目前为止，此疾病发生的分子机制尚不清晰，也无有效的治疗方法。为了进一步对此病进行研究，我们建立了针对中国人WSN病此突变的转基因动物模型，力争为该病的机制研究和治疗提供有效的实验动物。

发明内容

为了探讨WSN病发病的分子机理，我们在国际上首次建立了针对中国人的，可以模拟人类口腔白色海绵状斑痣临床病理表型的K4突变的转基因动物模型本发明提供的实验方法，其实验步骤如下：

一、探测中国人WSN患者的突变基因位点

2.用盐析法提取WSN患者的DNA。

3.设计引物：

K4F1 5’-GATTTGGGGGCTCCTTCAGTG-3’，

K4R1 5’-GGACTCAGGACCCCTCTCTTCTAAC-3’和

K4F2 5’-GGCACTGCTGACCACCTATCTAATG-3’，

K4R2 5’-GCCAAAGCCACTACTCAGGCC-3’，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增K4基因上的目的基因。

4.对扩增的K4基因进行测序。

5.发现中国人WSN患者的基因突变位点。

二、K4突变基因重组质粒的构建

2.利用STRATAGENE公司的点突变试剂盒在质粒pCMV6-XL4-KRT4的KRT4基因1829位上制造突变G变为A，使第520密码子由GAG突变为AAG，氨基酸由E突变为K，PCR及测序证明突变成功。

3.构建用于连接的linker：

A--MluI-AvaI--AvaI--BamHI--EcoRI--HindIII-A插入到T-vector中，然后分别利用限制性内切酶BamH I(241bp)、EcoR I(816bp)、HindIII(2479bp)进行重组，产生重组的KRT4基因。

将KRT4基因利用BamHI/HindIII插入表达载体pcDNA3.1(+/-)，完成K4转基因模型重组质粒的构建。

三、重组质粒转染

将重组质粒转染至LA795鼠肺癌细胞中进行培养，发现转染野生型cytokeratin4 cDNA重组质粒的细胞表现为长梭形，转染突变型的细胞则表现为不规则形或短梭形，说明基因突变影响了转染细胞中间张力丝的稳定性，从而引起细胞形态的改变。

此表现证实该突变为中国人WSN病的致病突变基因。

四、K4转基因动物模型的筛选与鉴定

1.用限制性内切酶PvuI将构建好的pcDNA3.1-KRT4进行线性化，纯化后进行显微注射，将K4基因的重组质粒导入小鼠受精卵中

2.对转基因首建鼠用PCR法进行检测鉴定。

3.将鉴定阳性的首建转基因小鼠和非转基因小鼠合笼，繁殖得到F1代小鼠。

4.利用聚合酶链式反应鉴定F1代转基因小鼠。

5.将鉴定阳性的F1代转基因小鼠，通过光镜、电镜、Western blotting、免疫组化、免疫荧光、原位杂交等方法，证实其蛋白和临床病理表型表现为白色海绵状斑痣的表现。

6.证实针对中国人白色海绵状斑痣的转基因动物模型构建成功。

借助分子生物学和胚胎工程的技术，将人类口腔WSN相关K4突变基因在体外扩增和加工，再导入动物的早期胚胎细胞中，使其整合到染色体上，当胚胎被移植到代孕动物的输卵管或子宫中后，发育成携带K4突变基因的转基因动物。