[发明专利]一种高效提取纯化油菜脂肪酶的方法

摘要

本发明一种高效提取纯化油菜脂肪酶的方法，按照下述步骤进行：(1)确定油菜最佳提取脂肪酶时间；(2)将提取的粗酶液边搅拌边向其中加入固体硫酸铵，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，该条件下脂肪酶的回收率为93.49％，纯化倍数达到1.06；(3)然后选用截留分子量为100000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩；(4)采用离子交换柱层析纯化超滤液中脂肪酶，得到油菜脂肪酶蛋白，纯度分别为3.13u/mg和9.14u/mg，总回收率为43.94％。本发明提供的油菜脂肪酶纯化过程中，区别于微生物脂肪酶分离纯化工艺，采用液氮研磨破碎植物细胞壁，溶解植物细胞质内脂肪酶和植物细胞膜内脂肪酶，提供了一种提取纯化植物细胞内分泌脂肪酶的方法，纯度高，回收率高，酶纯化倍数为4.83。

主权项

一种高效提取纯化油菜脂肪酶的方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)确定油菜最佳提取脂肪酶时间：在培养箱培养甘蓝型油菜品种，油菜种子萌发期间只提供水不外加碳源，种子吸涨完全时第一次取样，以后每隔1天取一次样，共10次，样品幼苗用液氮研磨至粉末，然后和含有1.2％曲拉通X-100的磷酸钠缓冲液，以质量与体积比3∶10混合，其中磷酸钠缓冲液为0.025M，pH＝7，12000rpm离心20min后取上清液，得粗酶液，分别测定粗酶液脂肪酶比活力；确定培养6天的油菜幼苗的脂肪酶比活力为1.89U/mg，其活性为最高；(2)将提取的粗酶液边搅拌边向其中加入固体硫酸铵，使其中的硫酸铵饱和度为10％，摇匀后静置30min，然后在转速4000r/min下离心10min，弃去上清液，沉淀再用40％饱和度的硫酸铵盐析，摇匀后静置30min，然后在转速4000r/min下离心10min，弃去上清液，将蛋白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，该条件下脂肪酶的回收率为93.49％，纯化倍数达到1.06；(3)然后选用截留分子量为100000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩，脂肪酶的比活力为2.46u/mg，回收率为75.84％；(4)采用离子交换柱层析纯化超滤液中脂肪酶，装柱后，用蒸馏水平衡；将上一步得到的处理液，蒸馏水稀释3倍后12000r/min离心10min后上柱，先后用氨水和含1mol/LNaCl的pH8的0.05mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，流速为5mL/min，出现2个洗脱峰；收集活性峰，透析，冷冻干燥，得到油菜脂肪酶蛋白，纯度分别为3.13u/mg和9.14u/mg，总回收率为43.94％。