[发明专利]一种高效提取纯化油菜脂肪酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取纯化植物脂肪酶的方法，特别是提取纯化油菜脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶属于分解三脂酰甘油的水解酶类，在油水界面上，脂肪酶催化三酰基甘油的酯键 水解，释放含有更少酯键的甘油酯或甘油及脂肪酸。脂肪酶在油脂水解和精炼、食品风味和 香味的改进、医药、皮革绢纺脱脂、洗涤剂和化妆品等行业中都有广泛的应用。

脂肪酶广泛的存在于植物和微生物中(Rohit S Y，Uttam C B 2001)。植物脂肪酶由于原材料 生长周期长、提取较困难等因素，其研究发展比微生物脂肪酶慢的多(吴秋明，叶兴乾，吴丹， 等2004)，目前，用植物材料制备脂肪酶的研究专利未见报道。常规制备脂肪酶的方法如中 尾正宏等发明的专利予公开NO.WO2007/066779中描述的方法-该方法中使用微生物，还有 舒正玉(生物工程学报，2007)和胡泊(微生物通报，2007)等研究者都是从微生物中制备脂 肪酶。但是植物脂肪酶的安全系数高于微生物脂肪酶，成本低廉，具有更广阔的应用价值和 前景。

本发明选用我国最主要的油料作物之一的油菜为材料。当油菜种子萌发时，脂肪酶能与 其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能 量(Teissere M，Borel M，Caillol B，et al 1995)。因此萌发期的油菜幼苗可以作为脂肪酶提取的植 物材料。本发明参考从微生物中提取纯化脂肪酶的方法，如从黑曲霉F044中分离纯化脂肪酶 所采用的“盐析→透析→阴离子交换层析”工艺路线(舒正玉，杨江科，闫云君生物工程学报， 2007)，以及从嗜冷枯草芽孢杆菌纯化低温脂肪酶所采用的“盐析疏水柱层析阴离子交换层析” 工艺路线(胡泊，吴胜，杨柳等微生物通报，2007)，从比活力最高时期的油菜幼苗中提取脂肪 酶并进行纯化，得到纯度较高的脂肪酶，从而建立了一种简单高效的油菜脂肪酶纯化方法。

发明内容

本发明为了克服微生物脂肪酶应用于食品行业安全系数较低等不足，提供一种从油菜中 高效提取纯化脂肪酶的方法。实现本发明的技术如下：

(1)确定油菜最佳提取脂肪酶时间：在培养箱培养甘蓝型油菜品种宁油12号，油菜种 子萌发期间只提供水不外加碳源，种子吸涨完全时第一次取样，以后每隔1天取一次样，共 10次，样品幼苗用液氮研磨至粉末，然后和含有1.2％曲拉通X-100(Triston X-100)的磷酸 钠缓冲液(0.025M，pH 7)以质量与体积比3∶10混合，12000rpm离心20min后取上清液， 得粗酶液，分别测定粗酶液脂肪酶比活力；发现培养6天的油菜幼苗的脂肪酶比活力为 1.89U/mg，其活性为最高；

(2)将提取的粗酶液边搅拌边向其中加入固体硫酸铵，使其中的硫酸铵饱和度为10％， 摇匀后静置30min，然后在转速4000r/min下离心10min，弃去上清液，沉淀再用40％饱和度 的硫酸铵盐析，摇匀后静置30min，然后在转速4000r/min下离心10min，弃去上清液，将蛋 白质沉淀用蒸馏水溶解得到盐析液，该条件下脂肪酶的回收率为93.49％，纯化倍数达到1.06；

(3)然后选用截留分子量为10000Da的超滤膜对脂肪酶盐析液进行浓缩，脂肪酶的比 活力为2.46u/mg，回收率为75.84％；

(4)采用M-Bondapak-C18离子交换柱层析纯化超滤液中脂肪酶，装柱后，用蒸馏水平 衡；将上一步得到的处理液，蒸馏水稀释3倍后12000r/min离心10min后上柱，先后用氨水 和含1mol/L NaCl的pH8的0.05mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，流速为5mL/min，出现2个洗脱 峰；收集活性峰，透析，冷冻干燥，得到油菜脂肪酶蛋白，纯度分别为3.13u/mg和9.14u/mg， 总回收率为43.94％。

本发明的优点：

1.本发明采用盐析和超滤相结合的方法，可以较为方便而高效地得到脂肪酶，进一步通 过M-Bondapak-C18柱层析，即可达到和商品猪胰脂肪酶活力相近的水平。

2.本发明提供的油菜脂肪酶纯化过程中，区别于微生物脂肪酶分离纯化工艺，采用液氮 研磨破碎植物细胞壁，溶解植物细胞质内脂肪酶和植物细胞膜内脂肪酶，提供了一种提取纯 化植物细胞内分泌脂肪酶的方法，纯度高，回收率高，酶纯化倍数为4.83。

附图说明