[发明专利]一种制备α-酮基丁酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，包括(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液的制备，(2)完整细胞转化α-羟基丁酸生成α-酮基丁酸，(3)转化液预处理，(4)转化液的脱色与浓缩，(5)α-酮基丁酸钠的结晶等步骤。本发明具有培养基简单、生长周期短，成本低，后续分离提取费用低廉，可耐底物浓度高，产物α-酮基丁酸钠纯度高等特点，为α-酮基丁酸钠的高效生产奠定了基础。

主权项

一种利用含α 羟酸氧化酶的细胞转化α 羟基丁酸制备α 酮基丁酸方法，其步骤顺序如下：(1)含α 羟酸氧化酶的完整细胞悬液的制备：选取含α 羟酸氧化酶的假单胞菌或不动杆菌，常规培养，期间以2，4 二硝基苯肼与α 酮基丁酸作用生成棕红色2，4 二硝基苯腙的方法检测细胞α 羟酸氧化酶活力，至α 羟酸氧化酶活力达到120～200单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2～7.5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2～4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α 羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；其中：在上述步骤中，α 羟酸氧化酶活单位U定义为：37℃，每分钟催化底物α 羟基丁酸钠转化生成1微摩尔α 酮基丁酸钠所需的酶量；(2)转化：将步骤(1)中制得的完整细胞悬液与α 羟基丁酸钠水溶液混合，并使混合物中α 羟基丁酸钠的浓度为100～800毫摩尔/升、完整细胞浓度为5～120克湿细胞/升；在5～37℃，pH 6.0～10.0条件下，以50～180转/分钟振荡5～30小时，使底物α 羟基丁酸钠、完整细胞与氧气充分混合，得含α 酮基丁酸钠的转化液；(3)转化液预处理：以步骤(2)转化液体积量计，加入其0.1～0.5％体积量的1％壳聚糖溶液，搅拌絮凝0.5～2小时，以5,000～10,000转/分离心5～25分钟，或者用200～400目滤布过滤，去除步骤(2)中加入的完整细胞，所得清液中即含α 酮基丁酸钠；(4)样品检测：按常规方法制作α 羟基丁酸钠和α 酮基丁酸钠在高效液相色谱条件下标准曲线；取1～5微升步骤(3)获得的含α 酮基丁酸钠清液进样，测定产物α 酮基丁酸钠的含量，计算底物转化率；(5)转化液的脱色：按常规方法将122弱酸性阳离子交换树脂或732强酸性阳离子树脂处理为H型，取步骤(3)获得的含α 酮基丁酸钠清液以每小时0.5～3.0倍柱体积流速过柱，至流出液pH为1～2开始收集，流出液pH为3～4时停止进样，收集流出液，静置0.5～2小时，以5,000～10,000转/分离心5～20分钟，收集上清液；(6)浓缩：取步骤(5)收集的上清液以1摩尔/升的NaOH调pH至中性，以0.06～0.1兆帕，40～80℃条件减压浓缩，待α 酮基丁酸钠的浓度为1～2.5摩尔/升时停止浓缩，得α 酮基丁酸钠的浓缩液；(7)α 酮基丁酸钠的结晶：取步骤(6)获得的浓缩液，加入其2～10倍体积量的无水乙醇，4～15℃下静置、结晶1～6小时，收集结晶，用其2～5倍体积的无水乙醇洗涤，然后在50±5℃温度下烘干，对所得α 酮基丁酸钠称重，计算分离过程收率；(8)α 酮基丁酸钠检测：步骤(7)所得的α 酮基丁酸钠产品，用HPLC检测纯度；其中，HPLC采用Agilent1100系统，层析柱为AminexHPX 87H，流动相为10毫摩尔/升硫酸，柱温为55℃。