[发明专利]一种制备α-酮基丁酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备α-酮基丁酸的方法，具体地说，涉及一种利用微生物完整细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸的方法。

背景技术

α-酮基丁酸(α-ketobutyric acid)，又称2-羰基丁酸(2-Oxobutyric acid)、2-氧代丁酸(2-Oxobutanoic acid)、2-酮基丁酸(2-Ketobutyric acid)。α-酮基丁酸是多种有用化合物的前体，在医药、食品合成工业具有广泛的应用，如合成异亮氨酸、保洛霉素及呋喃酮等《Production of 2-ketobutyric acid from 1，2-butanediol by resting cells of Rhodococcusequi IFO 3730.Biotechnol.Lett.1994，16：263-268.》。

α-酮基丁酸的生产方法包括化学合成法和生物技术法。化学合成α-酮基丁酸可以由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解进行。生物技术法包括发酵法和酶法。

Furuyoshi Setsuo等人报道利用恶臭假单胞菌催化巴豆酸生产α-酮基丁酸的方法《Microbial production of 2-oxobutyric acid from crotonic acid.Agric.Biol.Chem.1991，55：123-128.》。首先在N-甲基氧化吗啉存在的条件下，锇催化巴豆酸生成2，3-二羟基丁酸，此步产率约为53％。然后恶臭假单胞菌催化2，3-二羟丁酸生成α-酮基丁酸，在最适反应条件下，该步摩尔转化率为47％，α-酮基丁酸产量为4.8克/升。该方法需经两步催化过程，由巴豆酸到α-酮基丁酸的总体产率仅为25％，造成了底物的浪费。

美国专利(US Patent 7144715)报道应用一株粗糙脉胞菌的ilv-3突变体，以苏氨酸为底物发酵生产α-酮基丁酸，通过优化培养基配比，α-酮基丁酸产量可以达到8克/升，产率为90％《Production ofα-ketobutyrate.U.S.patent 7144715.》。

美国专利(US Patent 7015020)报道了一种利用丙酮酸脱羧酶催化的加成反应，以CO2和丙醛为底物生产α-酮基丁酸的方法。浓度为0.1毫摩尔/升的底物丙醛经反相液谱分离后，α-酮基丁酸产率为52％《Preparation of2-keto carboxylic acid from carbon dioxide.U.S.patent 7015020.》。

Nakahara Tadaatsu等人报道在以硫胺素为限制因素的培养基上，筛选得到的马红球菌IF0 3730可以以1，2-丁二醇为碳源生产α-酮基丁酸《Production of2-ketobutyric acid from1，2-butanediol by resting cells of Rhodococcus equi IFO 3730.Biotechnol.Lett.1994，16：263-268.》。经过32小时培养，马红球菌IF0 3730可将20克/升的1，2-丁二醇转变成15.7克/升的α-酮基丁酸，底物摩尔转化率约为68％。

以上报道虽已实现α-酮基丁酸的生物法合成，但其产量较低，难以产业化。α-羟基丁酸仅经一步氧化反应即可生成α-酮基丁酸，是生物法生产α-酮基丁酸的极佳底物。经检索利用含α-羟酸氧化酶的微生物细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸的方法未见报道。

发明内容

针对上述α-酮基丁酸制备方法的不足，本发明提供了一种生物法制备α-酮基丁酸的方法。该方法具有底物转化率高、产物浓度高、后提取简便等特点。

本发明的利用含α-羟酸氧化酶的细胞转化α-羟基丁酸制备α-酮基丁酸方法，其步骤顺序如下：

(1)含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液的制备：选取含α-羟酸氧化酶的假单胞菌或不动杆菌，常规培养，期间以2，4-二硝基苯肼(DNP)与α-酮基丁酸作用生成棕红色2，4-二硝基苯腙的方法检测细胞α-羟酸氧化酶活力，至α-羟酸氧化酶活力达到120～200单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7.2～7.5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2～4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到含α-羟酸氧化酶的完整细胞悬液，4℃储存备用；

其中：在上述步骤中，α-羟酸氧化酶活单位U定义为：37℃，每分钟催化底物α-羟基丁酸钠转化生成1微摩尔α-酮基丁酸钠所需的酶量；