[发明专利]一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法

摘要

本发明涉及一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法，该方法包括以下4个步骤：(1)芒果炭疽病病原菌基因组DNA的提取；(2)PCR扩增特异引物及反应条件；(3)酶切PCR扩增产物；(4)酶切产物分析；该检测方法对炭疽病病原菌抗性菌株的检出率为100％；本发明根据病原菌抗性菌株的特异酶切位点选择一对特异引物进行DNA片段(含特异酶切位点)扩增，利用限制性内切酶对扩增DNA片段进行酶切，将酶切产物进行电泳、凝胶成像可以准确判断病原菌是抗性菌株还是敏感菌株，经过多次试验表明，这种方法是稳定可靠的。

主权项

一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法，其特征在于：(1)芒果炭疽病病原菌基因组DNA的提取：(a)取病原菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养5～7天，取培养液过滤获得菌丝体，菌丝体冷冻干燥备用；(b)取15～25mg冷冻干燥菌丝体用液氮研磨，转入1.5mL离心管中，加入350～450μL60～70℃水浴的SDS提取缓冲液，充分混匀并于60～70℃水浴20～40min，间隔摇匀三次；(c)13000r/min离心10min，取250～350μL上清液，加入250～350μL的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，酚∶氯仿∶异戊醇为20～28∶22～26∶1～3，轻摇30～40个来回；(d)13000r/min离心10min，移上清液到新离心管，加180～250μL氯仿和异戊醇的混合溶液，氯仿和异戊醇的配比为20～25∶1～3，轻摇30～40个来回；(e)13000r/min离心5min，移上清液到新离心管，加1～3倍体积的无水乙醇和浓度为2mol/L的NaCl，使DNA充分沉淀；(f)13000r/min离心10min，待沉淀充分干燥后，用70％乙醇洗涤沉淀两次；(g)沉淀充分干燥后加入40～60μLTE缓冲液，60～70℃温浴1～1.5h，使沉淀完全溶解， 20℃保存病原菌基因组DNA备用；(2)PCR扩增特异引物及反应条件：利用正向引物序列PF1(5’ GCATGATGGCCACCTTCTC 3’)和反向引物序列PR1(5’ GAGCGAAGCCGACCATGAAG 3’)对病原菌基因组DNA进行PCR扩增，扩增条件：PCR反应体系50μL：25μL Premix Taq，1μL(100ng)DNA模板，正向引物4μL，浓度为100μmol/L，反向引物4μL，浓度为100μmol/L，16μL ddH2O；反应循环：94℃5min；94℃1min，55～63℃30s，72℃2min，30个循环；然后72℃5min，最后4℃保存PCR扩增产物；(3)酶切PCR扩增产物：取PCR扩增产物进行酶切反应，反应体系20μL：ACC II限制性内切酶1μL，浓度为12u/μL，2μL 10×MBuffer，DNA扩增产物1μg，扩增产物的DNA浓度采用核酸分析仪测定或与λDNA进行琼脂糖电泳比对测定，最后加超纯水至20μL，按反应体系加样至PCR管中置于37℃水浴45～60min，获得的酶切产物4℃保存备用；(4)酶切产物分析：取10μL酶切产物，点入含核酸燃料的1.2％琼脂糖凝胶中，在5V/cm条件下电泳20～30min后，把琼脂糖凝胶转移到自动凝胶成像系统进行拍照，以Marker DL2000比对，鉴定抗药性菌株。