[发明专利]一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病菌抗药性的检测方法，具体涉及一种芒果炭疽病对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法，属于病菌抗药性检测方法领域。

背景技术

苯并咪唑类(benzimidazoles)杀菌剂是20世纪60年代后期开发的一类重要药剂，可以防治大多数子囊菌、半知菌和担子菌引起的植物病害。此类化合物主要包括多菌灵(carbendazim)、苯来特(benomyl)、噻菌灵(thiabendazole)、麦穗宁(fuberidazole)、甲基托布津(thiophanate-methyl)等，此类药剂施用后，在植物体内会产生共同的衍生物多菌灵或它的乙基同系物乙基多菌灵，是与病菌相互作用的最后产物。此类药剂具有良好的内吸性能，因此被广泛应用于一些重要农作物主要病害的防治，其作用霸标是病原菌的β-微管蛋白，干扰细胞核的分裂，这类药剂作用位点单一，选择性较强，病原菌容易对其产生抗药性，目前，抗药性已成为制约这类杀菌剂被继续使用的最主要限制因素。

芒果炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides Penz.)是芒果最严重的病害之一，该病害在国内外芒果产区普遍发生。目前，对芒果炭疽病的防治以化学防治为主，多菌灵等苯并咪唑类杀菌剂对该病害具有较好的防治效果。但苯并咪唑类杀菌剂是一种单一作用位点的内吸性杀菌剂，容易产生抗药性，某些频繁使用苯并咪唑类杀菌剂的芒果产区已出现了抗药性现象，抗药性菌株的抗性水平较高，达到多菌灵失效的程度，导致了该病害的大爆发和流行。因此，为了能有效地控制该病害的发生与流行，有必要对田间病菌的抗药性情况进行及时、有效的监测，为抗药性治理提供理论依据及有效信息，最终达到控制该病害的目的。目前常用的抗药性检测方法有：生物测定法、生化测定法和运用核酸技术的检测方法，由于生物测定法和生化测定法需要时间较长，在短时间内很难提供病菌抗药性发生情况，随着分子生物学技术的快速发展，越来越多地利用分子检测方法，以便实现简便、高效的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法，制备一对特异性引物，以待测的芒果炭疽病菌的基因组DNA为模板进行扩增，获得PCR扩增产物后进行酶切，通过对酶切产物的电泳、凝胶成像可以快速准确的鉴定出抗性菌株和敏感菌株.

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一种芒果炭疽病菌对苯并咪唑类杀菌剂抗药性菌株的检测方法：

(1)芒果炭疽病病原菌基因组DNA的提取：

(a)取病原菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养5～7天，取培养液过滤获得菌丝体，菌丝体冷冻干燥备用；

(b)取15～25mg冷冻干燥菌丝体用液氮研磨，转入1.5mL离心管中，加入350～450μL60～70℃水浴的SDS提取缓冲液，充分混匀并于60～70℃水浴20～40min，间隔摇匀三次；

(c)13000r/min离心10min，取250～350μL上清液，加入250～350μL的酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，酚∶氯仿∶异戊醇为20～28∶22～26∶1～3，轻摇30～40个来回；

(d)13000r/min离心10min，移上清液到新离心管，加180～250μL氯仿和异戊醇的混合溶液，氯仿和异戊醇的配比为20～25∶1～3，轻摇30～40个来回；

(e)13000r/min离心5min，移上清液到新离心管，加1～3倍体积的无水乙醇和浓度为2mol/L的NaCl，使DNA充分沉淀；

(f)13000r/min离心10min，待沉淀充分干燥后，用70％乙醇洗涤沉淀两次；

(g)沉淀充分干燥后加入40～60μLTE缓冲液，60～70℃温浴1～1.5h，使沉淀完全溶解，-20℃保存病原菌基因组DNA备用；

(2)PCR扩增特异引物及反应条件：

利用正向引物序列PF1(5’-GCATGATGGCCACCTTCTC-3’)和反向引物序列PR1(5’-GAGCGAAGCCGACCATGAAG-3’)对病原菌基因组DNA进行PCR扩增，扩增条件：PCR反应体系50μL：25μL Premix Taq，1μL(100ng)DNA模板，正向引物4μL，浓度为100μmol/L，反向引物4μL，浓度为100μmol/L，16μL ddH₂O；反应循环：94℃5min；94℃1min，55～63℃30s，72℃2min，30个循环；然后72℃5min，最后4℃保存PCR扩增产物；