[发明专利]鲆鲽鱼类四倍体鱼苗批量化诱导方法

摘要

一种鲆鲽鱼类四倍体鱼苗批量化诱导方法，包括四倍体鱼苗的诱导方法和鉴定方法；诱导方法包括未受精卵的采集及授精；确定受精卵染色体加倍起始时间、静水压休克压力和处理时间；鉴定方法包括倍性测定仪鉴定和染色体分析鉴定。该方法首次建立了采用静水压诱导牙鲆等鲆鲽鱼类四倍体鱼苗的方法，筛选到抑制第一次卵裂、进行染色体加倍的静水压处理起始时间和静水压休克条件，建立了四倍体鱼苗批量化诱导的方法。采用本发明方法获得的四倍体鱼苗诱导率高达90％。本发明建立的方法具有先进、高效、准确、可靠的特点，在鱼类多倍体诱导和不育苗种生产中具有重要应用价值，在鱼类养殖和育种上具有广阔的推广应用前景。

主权项

1.一种鲆鲽鱼类四倍体鱼苗批量化诱导方法，其特征在于它的操作方法包括二个方面：(1)、四倍体鱼苗的诱导；(2)、四倍体鱼苗的鉴定；(1)、四倍体鱼苗的诱导：它的技术内容包括：(a)、未受精卵的采集及授精；(b)、染色体加倍起始时间的确定；(c)、静水压休克压力和处理时间的确定；(a)、未受精卵的采集及授精：选择性成熟的牙鲆雌鱼，在自然产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，将采集的鱼卵置于15-18℃；将采集的新鲜牙鲆精液或冷冻精液加入未受精卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的授精最小体积比为500μL∶50-100ml，加入2倍于卵量体积的温度为15-17℃的海水完成授精过程，授精过程在250ml烧杯中进行；(b)、染色体加倍起始时间的确定：在授精后60，65，68，70，73，78和80分钟的不同时间，将受精卵置于60--70Mpa静水压下进行休克处理，休克处理时间为5-7min，休克处理完毕后将卵移入15-17℃海水中培养；在原肠中期计算受精率，在鱼苗孵化出膜后，计算四倍体鱼苗的孵化率；在受精后65-73分钟进行静水压处理，都有20-90％的四倍体鱼苗产生，而只有在68和70分钟两个组的四倍体诱导率最高，达到80-90％；因此确定牙鲆四倍体鱼苗诱导的有效起始时间为受精后68-70分钟；(c)、静水压休克压力和处理时间的确定：根据确定的静水压休克起始时间，设计实验，将受精卵按休克压力和休克持续时间两因素进行正交试验设计，根据鱼的种类不同，设计的参数不尽相同；休克压力取62，65、67、72、80MPa几个水平，休克持续时间选定为5-7分钟，进行静水压休克处理；休克处理完毕后将卵移入15-17℃海水中培养；计数后代中四倍体产生情况，实验结果表明，牙鲆受精卵在62、65，67Mpa压力下休克处理5-7分钟，鱼苗都能孵化出膜，孵化率为27-44％；但只有在67Mpa压力下，休克处理6分钟，四倍体鱼苗的诱导率最高，达到90％。当采用67Mpa的静水压力时，牙鲆受精卵经过5、6或7分钟的休克处理，都能产生一定比例的四倍体鱼苗，不过只有休克处理6分钟时的四倍体鱼苗诱导率最高，达到80％左右；(2)、四倍体鱼苗的鉴定：它的技术内容包括：(a).通过倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗；(b).通过染色体分析鉴定四倍体鱼苗；(a).用倍性测定仪鉴定四倍体鱼苗：每次四倍体诱导实验，抽检孵化出膜后2-5天的四倍体实验鱼苗20-30尾；将每尾鱼苗放入1个1.5ml的离心管中，用蒸馏水清洗鱼苗1次，随后向每个离心管加入0.2-0.5ml一步法染色试剂，用碾磨棒将鱼苗碾碎成单细胞，制成单细胞悬液；全部磨好后，向每个管中加入0.8-1ml从PARTEC公司购买的鞘液，用滤膜过滤后，将滤液转入仪器配套的5ml试管中，轻弹试管，使细胞悬液混合均匀，然后将试管置于PARTEC倍性测定仪进行测定；测试样品，用正常二倍体胚胎作对照，再分析四倍体诱导组；通过细胞DNA含量分析，得知二倍体鱼苗细胞中的DNA含量绝大多数集中在30-35处，而四倍体鱼苗绝大多数细胞中的DNA含量在60-70，比二倍体鱼苗高1倍，因此证明我们诱导出的鱼苗为四倍体鱼苗；(b).染色体分析鉴定四倍体鱼苗：采用常规染色体制片方法，对牙鲆等鱼类人工诱导的四倍体鱼苗进行了染色体分析，牙鲆二倍体鱼苗的染色体数目为2n＝48条；而四倍体鱼苗的染色体数目为4n＝96，发现在优化的静水压休克下产生的鱼苗中90％以上的个体含有96条染色体，证明这些鱼苗为四倍体鱼苗。