[发明专利]鲆鲽鱼类四倍体鱼苗批量化诱导方法

说明书

技术领域：

本发明属于水产遗传育种技术，是一种采用物理学方法诱导鲆鲽鱼类四倍体的方法。

背景技术：

以牙鲆、大菱鲆和星鲽等为主的鲆鲽鱼类是我国重要的海水养殖鱼类，目前我国鲆鲽鱼类养殖的年产值接近100亿元。不过，许多鲆鲽鱼类因为性成熟比较早，由于性腺发育影响了鱼体生长和肉质、降低了商品质量，对这些鱼类开展不育技术的研究，研制出不育群体，对于提高这些鱼类的养殖产量和商品价值，非常重要。另外，目前我国引进的海水鲆鲽鱼类种类也越来越多，例如，漠斑牙鲆和大西洋牙鲆等；这些外来生物如果逃逸到自然界中，将会给我国海水生态环境和物种资源造成很大危害。因此，研制这些鱼类的高效不育技术，培育不育群体，在渔业生产中推广外来鱼类的不育苗种，这对于保护我国水域不受外来物种侵害、保护我国水产种质资源，显得非常迫切和急需。因此，采用现代生物技术手段，研究鲆鲽鱼类多倍体诱导技术、研制出四倍体鱼，然后与二倍体交配就可以生产不育的三倍体群体，从而可以大量生产鱼类不育群体，这对于缩短鲆鲽鱼类养殖周期，提高养殖产量，提高养殖的经济效益，推动鲆鲽鱼类养殖产业的发展，具有重要的现实意义和重大的应用价值。同时，多倍体不育苗种的推广必将产生巨大的经济和社会效益。

鉴于鱼类不育技术在遗传育种、渔业生产、水环境保护和水生生物遗传多样性保护上的重要意义和应用价值，国际上也非常重视鱼类等水产养殖动物不育技术的研究。而制作鱼类不育的主要途径是生产三倍体。因为三倍体鱼类具有控制过度繁殖、抑制性腺发育、促进生长以及提高鱼肉品质等优点，因而受到普遍的重视。鱼类多倍体的绝大多数研究工作是在淡水鱼类上开展的。迄今已先后获得了草鱼、斑点叉尾鮰、罗非鱼、虹鳟，银大马哈鱼、大鳞大马哈鱼、大西洋鲑、白鲢和鲤等鱼类三倍体；西班牙学者(2000)采用冷休克方法诱导了大菱鲆三倍体，获得三倍体鱼苗。另外，在英国和日本，三倍体虹鳟也进入了商业化养殖。除虹鳟外，日本还开展了诱导三倍体香鱼的研究与开发，发现三倍体香鱼的生长速率和抗寒能力都明显优于二倍体香鱼，很受消费者和养殖家的欢迎，具有很大的商业价值和开发潜力。不过，上述研究都是采用冷休克方法通过抑制第二极体排出使染色体加倍，直接诱导三倍体。由于三倍体诱导率很低，生产的三倍体鱼苗数量非常有限，达不到商业生产的目的，因此，直接诱导三倍体的方法难以达到实用化的要求。迄今为止，有关海水鲆鲽鱼类四倍体的批量化诱导，通过四倍体和二倍体交配生产三倍体不育鱼苗，国内外尚无报道。

发明内容：

本发明的目的是要克服鱼类三倍体诱导效率低、难以大规模推广应用、只能当代使用、不能建立繁殖群体的缺点，建立通过抑制鱼类受精卵第一次卵裂、大量诱导产生四倍体鱼苗的方法。即采用现代生物技术手段，研究鲆鲽鱼类多倍体诱导技术、研制出四倍体鱼，然后与二倍体交配生产不育的三倍体群体，从而可以大量生产鱼类不育群体，

本发明其技术内容如下：

包括二个方面：一、四倍体鱼苗的诱导；二、四倍体鱼苗的鉴定。

一、四倍体鱼苗的诱导：

它的技术内容包括：1、未受精卵的采集及授精；2、染色体加倍起始时间的确定；3、静水压休克压力和处理时间的确定。

1、未受精卵的采集及授精：

选择性成熟的牙鲆雌鱼，在自然产卵前1h采用人工挤压腹部法采卵，将卵采入干燥的烧杯中，将采集的鱼卵置于15-18℃；将采集的新鲜牙鲆精液或冷冻精液加入未受精卵中，轻轻摇动混匀，精液和卵的授精最小体积比为500μL：50-100ml，加入2倍于卵量体积的温度为15-17℃的海水完成授精过程。授精过程在250ml烧杯中进行。

2、染色体加倍起始时间的确定：

在授精后60，65，68，70，73，78和80分钟的不同时间，将受精卵置于60--70Mpa静水压下进行休克处理，休克处理时间为5-7min，休克处理完毕后将卵移入15-17℃海水中培养。在原肠中期计算受精率，在鱼苗孵化出膜后，计算四倍体鱼苗的孵化率。在受精后65-73分钟进行静水压处理，都有20-90％的四倍体鱼苗产生，而只有在68和70分钟两个组的四倍体诱导率最高，达到80-90％。因此确定牙鲆四倍体鱼苗诱导的有效起始时间为受精后68-70分钟。

3、静水压休克压力和处理时间的确定：

根据确定的静水压休克起始时间，设计实验，将受精卵按休克压力和休克持续时间两因素进行正交试验设计，根据鱼的种类不同，设计的参数不尽相同；休克压力取62，65、67、72、80MPa几个水平，休克持续时间选定为5-7分钟，进行静水压休克处理。休克处理完毕后将卵移入15-17℃海水中培养。