[发明专利]一种海绵共生放线菌的分离筛选方法

摘要

本发明涉及放线菌，具体地说是一种海绵共生放线菌的分离筛选方法，其以海绵样品为分离源，通过样品前预处理和模拟海绵体内元素组成配制微量元素作为培养基配方之一，以复合维生素作为生长因子促进放线菌生长，配制海绵放线菌液体(或固体)培养基，通过富集培养、平板筛选、菌株的分离纯化等步骤可以最终得到海绵共生放线菌。本发明适用于不同环境的海绵共生放线菌的分离培养，为医药中间体、农药化学等工业领域提供活性化合物。

主权项

一种海绵共生放线菌的分离筛选方法，具体工艺步骤如下：1)取采集的海绵样品，用无菌手术刀切块后称重，样品块于装有无菌海水的烧杯中洗涤3～5次，洗去样品表面附着的微生物和其它杂质；2)将样品室温干燥后研成粉末，放入60～80℃干燥箱中干燥≥1小时，取出样品凉至室温；3)取凉至室温的样品，每800～1000mg样品加入8～10ml含质量浓度0.1％脱脂奶粉的1OmM的MOPS(3-吗啉丙磺酸)，27～28℃振荡培养≥1小时，1000～1200×g离心10～15分钟，取0.1～0.2mL的上清均匀涂布于海绵放线菌固体培养基平板上，27～28℃培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况；4)另取8～10ml上清加入100ml海绵放线菌液体培养基中，在三角烧瓶中摇瓶富集培养≥24小时，温度为27～28℃，转速为150～250转/分钟；5)取富集培养后的海绵放线菌液体培养基0.5ml，加入装有4.5ml无菌海水的试管中涡旋混匀作为原液，原液进行10-1、10-2、10-3系列稀释作为备用菌液；6)分别取上述稀释操作中各步的备用菌液0.1～0.2ml均匀涂布于海绵放线菌固体培养基平板，每种稀释度的备用菌液涂5～10个平板；27～28℃培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况；当平板上出现螺旋形、放线状气生菌丝或坚硬光滑的典型放线菌菌落后，挑取单菌落在海绵放线菌固体培养基平板上划线；划线后的平板再于27～28℃培养箱中倒置培养5～7天，挑取单菌落继续在海绵放线菌固体培养基平板上划线培养，重复这一过程3～5次；直到菌落长成纯的单菌落；7)挑取纯的单菌落接种海绵放线菌液体培养基在试管中27～28℃，150～250转/分钟培养48～72小时，观察培养液出现明显菌丝体成球后，取菌液加入装有体积浓度15～20％甘油水溶液的冻存管中，颠倒混匀，-70℃放置保存备用。