[发明专利]一种海绵共生放线菌的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及放线菌，具体地说是海洋环境中海绵共生放线菌的分离筛选的新方法。

背景技术

放线菌属于好氧革兰氏细菌，通常具有类似真菌的孢子丝，它们在自然环境中广泛分布。放线菌是一大类有益次级代谢产物的生产者。目前所使用的抗生素中，70％是由放线菌产生。而已知的微生物来源的抗肿瘤化合物，都源自于放线菌。另外放线菌的次级代谢产物还表现在抗病毒、抗感染、抗寄生、酶抑制剂等。

就海洋中放线菌而言，在海水、海泥和海洋生物中也广泛存在。国际上报道的来源于海洋微生物活性物质中，其中有一半以上来自放线菌，这说明了在海洋微生物资源和相关产物开发过程中，放线菌仍是主力军。而且从海洋放线菌分离得到的化合物具有不同于陆地放线菌的特殊结构，其活性也是令人欣喜。

海绵是一种原始的无脊椎动物，属于底栖滤食性动物，生活在海洋中的岩石上，在海绵滤食过程中，许多微生物尤其是不能被消化的微生物得以在海绵体内保留，这样在海绵体内和体表就富集了大量的微生物。这些微生物分布在海绵宿主细胞的胞外和胞内，如海绵外层的胞外共生微生物和海绵中胶层的胞内共生微生物。胞内(包括细胞质内和细胞核内)的微生物可以长久的存在于细胞和细胞核内。通过传统培养和分子生物学方法发现海绵中存在大量丰富的共生放线菌资源，仅有少部分放线菌获得了纯培养，绝大部分放线菌用目前分离培养方法不能获得纯培养，尤其是一些胞内的共生微生物，分离和培养的难度较大。为了提高海绵共生放线菌的可培养性，本方法在筛选方法上做了改进，包括样品前处理和选择性培养基两方面。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便易行、快速有效的海绵共生放线菌的分离筛选新方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

将采集海绵样品，通过改进的方法对样品前处理后，将它们涂布在特定的培养基中培养。样品前处理包括：将采集的海绵样品室温干燥后研成粉末，放入60～80℃干燥箱干燥，取出样品凉至室温后，加入含0.1～0.2％脱脂奶粉10mM的MOPS(3-吗啉丙磺酸)，27～28℃振荡培养1～2小时，离心，保留上清，分成两份备用。以HVA为基础培养基，向其中加入微量元素作为培养基组成成份之一(微量元素的应用是模拟海绵微环境元素组成的含量配制微量元素加入到培养基中)，基质选择以胶凝糖代替琼脂，碳源选择用腐殖酸或几丁质配制成海绵放线菌液体(或固体)培养基。取一份上清直接均匀涂布于海绵放线菌固体培养基进行培养观察，将另一份上清先用海绵放线菌液体培养基进行富集培养，然后再涂布于海绵放线菌固体培养基进行培养观察。用此方法筛选得到多个种属的放线菌菌株，说明本发明方便有效性。

一种海绵共生放线菌的分离筛选方法，经过上述的海绵样品前处理和培养基的改进，分离筛选到了多样性的海绵共生放线菌，具体工艺步骤如下：

1)取采集的海绵样品，用无菌手术刀切块后称重，样品块于装有无菌海水的烧杯中洗涤3～5次，洗去样品表面附着的微生物和其它杂质；

2)将样品室温干燥后研成粉末，放入60～80℃干燥箱中干燥≥1小时，取出样品凉至室温；

3)取凉至室温的样品，每800～1000mg样品加入8～10ml含质量浓度0.1％脱脂奶粉的10mM的MOPS(3-吗啉丙磺酸)，27～28℃振荡培养≥1小时，1000～1200×g离心10～15分钟，取0.1～0.2mL的上清均匀涂布于海绵放线菌固体培养基平板上，27～28℃培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况；

4)另取8～1Oml上清加入100ml海绵放线菌液体培养基中，在三角烧瓶中摇瓶富集培养≥24小时，温度为27～28℃，转速为150～250转/分钟；

5)取富集培养后的海绵放线菌液体培养基0.5ml，加入装有4.5ml无菌海水的试管中涡旋混匀作为原液，原液进行10^-1、10^-2、10^-3系列稀释作为备用菌液；

6)分别取上述稀释操作中各步的备用菌液0.1～0.2ml均匀涂布于海绵放线菌固体培养基平板，每种稀释度的备用菌液涂5～10个平板；27～28℃培养箱中倒置培养，观察菌株生长情况；当平板上出现螺旋形气生菌丝或坚硬光滑的典型放线菌菌落后，挑取单菌落在海绵放线菌固体培养基平板上划线；划线后的平板再于27～28℃培养箱中倒置培养5～7天，挑取单菌落继续在海绵放线菌固体培养基平板上划线培养，重复这一过程3～5次；直到菌落长成纯的单菌落；