[发明专利]一种基因共表达重组质粒及由该质粒制成的DNA疫苗

摘要

一种基因共表达重组质粒及由该质粒制成的DNA疫苗，其特征在于依次包括鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程、重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程、鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR扩增过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2的构建过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2培养过程提取过程。本发明与已有技术相比，具有防御素所特有的免疫增强作用的、适合鸡使用的、可用于预防鸡传染性法氏囊病的优点。

主权项

1、一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2，其特征在于依次包括鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程、重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程、鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR扩增过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2的构建过程、鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2培养过程提取过程，鸡防御素-1基因片段的PCR扩增过程依次是：1、根据国内外已在GenBank中登录的鸡防御素基因-1基因序列分别经多重比较后设计引物，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，鸡防御素基因-1上游引物设计从去掉了前导肽处开始，加上起始密码字ATG及Hind III酶切位点；下游引物设计在基因末端，去除了终止密码字TGA，并加上BamH I酶切位点，鸡防御素基因-1上、下游引物序列为：鸡防御素基因-1上游引物：5’-CGAAGCTTAAACCATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3’鸡防御素基因-1下游引物：5’-TTGGATCCGCCCCATATTCTTTTGC-3’；2、以重组质粒pGEM-T-Gal-1为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸡防御素基因-1上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer5μL，4×dNTPs4μL，浓度均为20μmol/L的鸡防御素基因-1上、下游引物各1μL，pGEM-T-gal-1质粒1μL，ddH2O 37.5μL，浓度为5μmol/L的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为：a、95℃处理3min；b、依次94℃处理45s、55℃处理45s、72℃处理1min；反应过程进行30个循环；c、72℃延伸10min；即获得鸡防御素-1基因片段的PCR产物，鸡防御素-1基因片段序列：ATGGGAAGGAAGTCAGATTGTTTTCGAAAGAGTGGCTTCTGTGCATTTCTGAAGTGCCCTTCCCTCACTCTCATCAGTGGGAAATGCTCAAGATTTTACCTCTGCTGCAAAAGAATATGGGGC，重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建过程：将鸡防御素-1基因片段的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解，鸡防御素-1基因片段的PCR产物用BamH I、Hind III进行双酶切处理，胶回收130bp的条带，以同样的方法对pcDNA3.1(+)质粒进行双酶切处理，胶回收5.4kb左右的DNA片断，取5μL双酶切后胶回收的鸡防御素-1基因片段及3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)质粒，加入1μL 10×T4DNA连接Buffer，1μL的T4DNA连接酶，16℃连接18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养，即完成重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1的构建，鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR扩增过程依次包括：1、根据国内外已在GenBank中登录的鸡法氏囊病病毒VP2基因序列分别经多重比较后设计引物，根据真核表达载体pcDNA3.1(+)上的酶切位点，鸡法氏囊病病毒VP2基因上游引物加上EcoR I酶切位点并加多1个碱基T用于ORF框的正确通读，下游引物设计在基因末端，加上终止密码字TGA并加上Xho I酶切位点，鸡法氏囊病病毒VP2基因上、下游引物为：鸡法氏囊病病毒VP2基因上游引物：5’-CGAAGCTTAAACCATGGGAAGGAAGTCAGATTG-3’鸡法氏囊病病毒VP2基因下游引物：5’-TTGGATCCGCCCCATATTCTTTTGC-3’2、以重组质粒pGEM-T-VP2为模板，加入ExTaq DNA聚合酶、鸡法氏囊病病毒VP2基因上下游引物、dNTPs进行扩增反应，PCR的反应体系为：10×PCR Buffer 5μL，4×dNTPs4μL，浓度均为20μmol/L的鸡法氏囊病病毒VP2基因上、下游引物各1μL，pGEM-T-VP2质粒1μL，ddH2O 37.5μL，浓度为5μmol/L ExTaq DNA聚合酶0.5μL，反应过程依次为：a、95℃处理3min；b、依次94℃处理40s、56℃处理45s、72℃处理90s；b过程进行30个循环；c、72℃延伸10min，即可获得鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR产物，鸡法氏囊病病毒VP2基因序列：ACGAACCTGCAAGATCAAACCCAACAGATTGTTCCGTTCATACGGAGCCTTCTGATGCCAACAACCGGACCGGCGTCCATTCCGGACGACACCCTAGAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACAATTTGACTGTGGGGGACACAGGGTCAGGGCTAATTGTCTTTTTCCCTGGTTTCCCTGGCTCAATTGTGGGTGCTCACTACACACTGCAGAGCAATGGGAGCTACAAGTTCGATCAGATGCTCCTGACTGCCCAGAACCTACCGGCCAGCTACAATTACTGCAGGCTAGTGAGTCGGAGTCTCACAGTGAGGTCAAGCACACTCCCTGGTGGCGTTTATGCACTAAATGGCACCATAAACGCCGTGACCTTCCAAGGAAGCCTGAGTGAACTGACAGATGTTAGCTACAATGGGTTGATGTCTGCAACAGCCAACATCAACGACAAGATCGGGAACGTCCTAGTAGGGGAAGGGGTAACTGTCCTCAGCTTACCCACATCATATGATCTTGGGTATGTGAGACTCGGTGACCCCATTCCCGCTATAGGGCTCGACCCAAAAATGGTAGCAACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACCATAACTGCAGCCGATGATTACCAATTCTCATCACAGTACCAAGCAGGTGGAGTAACAATCACACTGTTCTCAGCTAATATCGATGCCATCACAAGCCTCAGTATCGGGGGAGAACTCGTGTTTCAAACAAGCGTCCAAGGCCTTATACTGGGTGCTACCATCTACCTTATAGGCTTTGATGGGACTGCGGTAATCACCCGAGCTGTGGCCGCAGACAATGGGCTAACGGCCGGCACTGACAACCTTATGCCATTCAATATTGTGATTCCAACCAGCGAGATAACCCAGCCAATCACATCCATCAAACTGGAGATAGTGACCTCCAAAAGTGGTGGTCAGGCGGGGGATCTGATGTCATGGTCAGCAAGTGGGAGCCTAGCAGTGACGATCCACGGTGGCAACTATCCAGGGGCCCTCCGTCCCGTCACACTAGTAGCCTACGAAAGAGTGGCAACAGGATCTGTCGTTACGGTCGCTGGGGTGAGCAACTTCGAGCTGATCCCAAATCCTGAACTAACAAAGAACCTGGTCACAGAATACGGCCGATTTGACCCAGGAGCCATGAACTACACAAAATTGATACTGAGTGAGAGGGACCGTCTTGGCATCAAGACCGTATGGCCAACAAGGGAGTACACTGACTTTCGCGAGTACTTCATGGAGGTGGCCGACCTCAACTCCCCCCTGAAGATTGCAGGAGCATTTGGCTTCAAAGACATAATTCGGGCACTAAGGTGATGA，鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2的构建过程：将鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR产物用氛氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解，鸡法氏囊病病毒VP2基因的PCR产物用EcoR I和Xho I双酶切处理，胶回收约1400bp大小的条带，以同样的方法对重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1进行双酶切处理，胶回收5.5kB左右的DNA片断，取5μL双酶切后胶回收的鸡法氏囊病病毒VP2基因片断及3μL双酶切后胶回收的pcDNA3.1(+)-Gal-1质粒片段，加入1μL的10×T4 DNA连接Buffer，1μL的T4 DNA连接酶，16℃连接18小时，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养，即完成鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2的构建，鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2培养过程提取过程：从LB固体培养基中挑取单个白色菌落，接种于盛有10ml含氨苄青霉素的LB液体培养液的三角瓶中，37℃震荡过夜培养。在1000ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入5ml的菌种，37℃，在200rpm/min转速下摇动，培养20h。用常规提取质粒的碱烈解方法进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附法进行纯化即可获得鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达重组质粒pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2；真核表达载体pcDNA3.1(+)为Invitrogen公司的产品，鸡防御素-1基因的重组质粒pGEM-T-Gal-1及含鸡法氏囊病病毒VP2重组质粒pGEM-T-VP2为华南农业大学动物科学学院家禽研究室构建、保存提供，使用的限制性内切酶EcoR I、Xho I、T4DNA连接酶、ExTaq DNA聚合酶等均购自广州宝泰克生物科技有限公司。