[发明专利]一种基因共表达重组质粒及由该质粒制成的DNA疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与鸡防御素-1基因共表达DNA疫苗pcDNA3.1(+)-Gal-1/VP2。

背景技术

传染性法氏囊病（infectious burasl disease, IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious burasl disease virus, IBDV）引起的一种高度接触性传染性疾病。主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊，破坏法氏囊中的B淋巴细胞，导致免疫抑制。使鸡对其他疫苗的免疫应答能力下降，对疾病易感。自20世纪70年代传入我国以来，IBD在全国形成了几次流行爆发，给我国的养鸡业造成沉重的打击。

迄今为止，对于传染性法氏囊病仍无有效的治疗方法，通过免疫接种提高鸡的抵抗力仍然是防制IBD的最佳选择。目前所研制的IBD疫苗主要分灭活疫苗、活疫苗（分为弱毒型、中等毒力型和强毒型）、基因工程苗和联苗等。现在普遍应用的仍然是活疫苗和灭活苗。人们为了防制高致病力的IBDV，通常采用中等毒力或强毒株来研制疫苗。活疫苗毒力太强或太弱都会影响最后的免疫效果。灭活疫苗需要使用剂量大，制备需免疫佐剂，不能诱导机体产生细胞免疫。另外，疫苗的滥用、免疫程序的不合理也很容易损伤鸡的法氏囊组织，导致免疫机能下降，免疫抑制，使鸡只对其他疾病的易感性提高，及对其他疫苗的免疫应答能力下降。随着细胞工程和基因工程技术的发展，目前研究的热点已转向基因工程疫苗的研制。研制一种安全有效的新型疫苗特别是基因工程疫苗成为当前研究的热点。相对于传统疫苗，基因工程疫苗的生产完全在体外进行，不需要以易感动物为载体来获得病毒制备活疫苗或者灭活苗；疫苗不含有能够引起鸡群发病的成分，没有散毒的危险。很多学者一直致力于IBD的基因工程疫苗的研究。热点主要还是DNA疫苗和亚单位疫苗。DNA疫苗是将含有编码抗原基因的质粒DNA直接导入体内，使抗原基因在体内表达，诱导机体产生免疫应答，包括中和抗体、细胞毒淋巴细胞和辅助T细胞（Hassett et al，1996）。这种疫苗表达的蛋白能够以天然抗原形式被免疫系统识别，热稳定性好，免疫力持久。

IBDV属于双RNA病毒科禽双RNA病毒属。分为I型和II型两个血清型。只有I型IBDV的某些毒株对鸡具有致病力。IBDV具有五种成熟蛋白，VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。其中VP2和VP3是主要的结构蛋白。VP2位于多聚蛋白的N端，分子量约为40kD，由451个氨基酸残基组成，它含有血清型特异性的能诱导中和抗体的抗原决定簇，是病毒的主要宿主保护性免疫原（Hudson et al，1986）。VP2上的抗原决定簇为构象依赖性的，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主免受IBDV的感染（Azad et al，1987；Becht et al，1988）。同时VP2还是一种凋亡因子，能诱导多种细胞凋亡（吕英姿，1999）。因此，在IBDV的分子生物学研究中，VP2蛋白的研究具有非常重要的地位。步志高等（2000）将D78株的VP2基因插入真核表达质粒中，免疫SPF鸡。结果表明VP2基因DNA免疫能够诱导SPF鸡产生中和抗体，对IBDV超强毒株的攻击具有保护作用。Pitcovski et al（2003）将VP2基因在Pichia pastoris表达系统中表达，扩增后用其对鸡群进行免疫，取得良好的效果。Hulse et al（2002）将IBDV标准强毒株STC的VP2基因克隆到真核表达载体中，纯化质粒DNA后胸部肌肉注射免疫2周龄雏鸡。结果在胸肌、胸腺、脾脏和法氏囊中均可发现VP2基因，但在盲肠扁桃体中则没有。证明质粒DNA直接注射鸡的胸肌后，在注射部位能转录和翻译目的基因，并能分布在一级和二级淋巴组织中。姜平等（1998）用VP2、VP3重组质粒DNA免疫14日龄的仔鸡，结果表明，VP2基因重组质粒除了可诱导产生较高的ELISA抗体之外，还可明显降低发病率和死亡率。单一抗原VP2 DNA疫苗预防鸡传染性法氏囊病虽然效果不错，但也存在免疫反应性不够强、免疫原性弱、保护力相对不够高等缺陷。如何更好的提高DNA疫苗免疫效果，提高机体免疫应答水平，是当前DNA疫苗研究的关键问题。