[发明专利]一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法

摘要

本发明公开了一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，该方法以紫杉醇合成的关键酶基因作为分子标记，基于PCR扩增技术快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，它根据已经报道的红豆杉的10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶和C-13苯丙氨基侧链CoA乙酰基转移酶基因的保守区设计引物，对从红豆杉树皮中分离得到的真菌依次进行扩增筛选，然后对可以扩增出这两个基因的真菌进行发酵培养并提取紫杉醇，用HPLC和MS对真菌紫杉醇进行分析，并最终确定产紫杉醇的内生真菌。本发明为实现由微生物发酵法取代从红豆杉植物组织中提取紫杉醇的转化，提供了有效的菌种分离筛选方法及一批有效的出发菌株。

主权项

1、一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，包括以下步骤：(1)从红豆杉树皮组织采用常规的内生真菌的分离法分离、纯化内生真菌；(2)对步骤(1)得到的内生真菌中进行dbat基因的扩增：分离、纯化后的内生真菌接种在30～50mL的土豆葡萄糖液体培养基中，23℃～28℃、120～200rpm培养3～5天，采用SDS-CTAB法提取真菌基因组DNA，然后，5～50株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取0.2～0.5μL混合做模板，进行10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶基因(dbat)的扩增检测；其引物为dbat-F(5’-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3’)和dbat-R(5’-GTTACCTGAACCACCAGAGG-3’)；反应体系采用标准的PCR反应体系，包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50～100μMdbat-F和50～100μMdbat-R，100～200μMdNTPs，5μL10×PCR reaction buffer和1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH2O补足到50μL；PCR扩增条件为94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，50℃～53℃、30sec～50sec，68℃～72℃、50sec～1min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有dbat基因条带的内生真菌筛选组，进行再次分组扩增dbat基因，或者直接对筛选组内的每个真菌进行dbat基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增有dbat基因条带的内生真菌；(3)对含有dbat基因的内生真菌进行bapt基因的扩增，得到产紫杉醇内生真菌：对扩增有dbat基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶基因(bapt)的扩增检测；引物为bapt-F(5’-CCTCTCTCCGCCATTGACAA-3’)和bapt-R(5’-TCGCCATCTCTGCCATACTT-3’)；反应体系采用标准的PCR反应体系，包括30～100ng真菌基因组DNA，50～100μMbapt-F和50～100μMbapt-R，100～200μM dNTPs，5μL10×PCR reaction buffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH2O补足到50μL；PCR扩增条件为：94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，53℃～55℃、50sec～1min，68℃～72℃、1min～1.2min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，并收集扩增有bapt基因条带的真菌，即产紫杉醇内生真菌。