[发明专利]一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物生物技术、生物制药领域，具体涉及一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法。

背景技术

紫杉醇是目前国际上公认的重要抗肿瘤药物。由于红豆杉资源的不足导致紫杉醇价格的昂贵，影响其在临床上的广泛应用。利用微生物发酵生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的有效途径之一。

自1993年Stierle等首次报道了从太平洋红豆杉树中分离到一株可产紫杉醇的内生真菌以来，国内外只有几十种产紫杉醇内生真菌的报道，原因之一就是产紫杉醇内生真菌的筛选不易。直至目前，对于产紫杉醇内生真菌的筛选方法依然和1993年Stierle等所用方法相似，即通过对分离的内生真菌用大瓶发酵培养后，从发酵液或菌丝体中提取紫杉醇，用薄层层析、高效液相色谱、质谱、单抗免疫分析等手段对抽提物进行分析，通过确定抽提物是否含有紫杉醇进而确定内生真菌是否产紫杉醇。然而，薄层层析法虽简单廉价，但检测的准确度不够；高效液相色谱、质谱、单抗免疫分析等方法虽检测灵敏、准确度高，但其使用成本也很高。如果对几十株、上百株真菌都进行大量培养、紫杉醇提取、纯化，并利用高效液相色谱、质谱、单抗免疫分析等这些灵敏、准确的检测方法进行检测、筛选，将是一个十分耗时耗材的工作。

所以，建立一种快速有效的高通量筛选产紫杉醇内生真菌的方法是提高其开发利用的必需因素之一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，该方法具有速度快、筛选率高等优点，有助于更好地开发利用产紫杉醇内生真菌资源。

本发明提供的快速筛选产紫杉醇内生真菌的方法，包括以下步骤：

(1)采用常规的内生真菌的分离法从红豆杉及红豆杉近缘科属植物的树皮组织分离、纯化内生真菌；

(2)对步骤(1)得到的内生真菌中进行dbat基因的扩增：

分离、纯化后的内生真菌接种在30～50mL的土豆葡萄糖液体培养基中，23℃～28℃、120～200rpm培养3～5天，采用SDS-CTAB法提取真菌基因组DNA，然后，5～50株真菌基因组DNA作为一个筛选组，各取0.2～0.5μL混合做模板，进行10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰基转移酶基因(10-deacetyl baccatin III-10-O-acetyl transferase，DBAT)的扩增检测；其引物为dbat-F(5’-GGGAGGGTGCTCTGTTTG-3’)和dbat-R(5’-GTTACCTGAACCACCAGAGG-3’)。

PCR反应体系组成包括用于一个筛选组的混合真菌基因组DNA，50～100μM dbat-F和50～100μM dbat-R，100～200μM dNTPs，5μL 10×PCRreaction buffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL；

PCR扩增条件为：94℃～96℃、3～6min；93℃、50sec～1min，50℃～53℃、30sec～50sec，68℃～72℃、50sec～1min，共进行30～35个循环；之后，68℃～72℃再延伸7～10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析后，选择扩增有dbat基因条带的内生真菌筛选组，进行再次分组扩增dbat基因，或者直接对筛选组内的每个真菌进行dbat基因的扩增，最终，通过琼脂糖凝胶电泳分析，收集所有扩增有dbat基因条带的内生真菌；

(3)对含有dbat基因的内生真菌进行bapt基因的扩增，得到产紫杉醇内生真菌：

对扩增有dbat基因条带的真菌再进行C-13苯丙氨基侧链CoA酰基转移酶(C-13 phenylpropanoid side chain-CoA acyltransferase，BAPT)基因的扩增检测。引物为bapt-F(5’-CCTCTGTCCGCCATTGACAA-3’)和bapt-R(5’-TCGCCATCTCTGCGATACTT-3’)；

反应体系采用标准的PCR反应体系，包括30～100ng真菌基因组DNA，50～100μM bapt-F和50～100μM bapt-R，100～200μM dNTPs，5μL10×PCR reaction buffer，1～2.5units Taq DNA polymerase，用灭菌ddH₂O补足到50μL；