[发明专利]一种用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法

摘要

本发明公开了一种用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。在AFLP指纹技术的基础上，以特定不同青菜品种的基因池为模版，以限制性内切酶EcoR I和Mse I酶解，然后酶切片段跟含有与其共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点来设计引物，并以特定引物对青菜不同品种的预扩增、选择性扩增共两次扩增为依据，构建青菜品种的标准DNA指纹图谱，将待定的青菜品种样本与标准图谱相比较，以鉴定待测样品的品种真实性。本发明为保护青菜育种产权、新品种登录、鉴定品种的真实性和纯度提供技术保障。

主权项

1、用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法，其特征在于其步骤如下：(1)基因池DNA的来源从不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列接头的碱基序列：EcoR I接头 5′＞CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA＜5′Mse I接头 5′＞GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT＜5′预扩增引物EcoR I预扩引物序列：5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’Mse I 预扩引物序列：5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’选扩增引物Mse I扩增引物用FAM标记Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3：GAT GAG TCC TGA GTA ACA GPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-2：GAT GAG TCC TGA GTA ACA CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-6：GAT GAG TCC TGA GTA ACT CPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-8：GAT GAG TCC TGA GTA ACT TPrimer E GAC TGC GTA CCA ATT CAC A/MseI-5：GAT GAG TCC TGA GTA ACT A(3)AFLP反应条件A、酶切和连接限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50pmoles/μL，EcoR I接头5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃10h；B、预扩增在0.2ml离心管中按下列方式加入(25ul反应体系)：模板DNA 2μl，预扩引物1μl(50ng/μl每种)，dNTPs 1μl(10mM)，10×PCR buffer 2.5μl，Taq DNA polymease 0.5μl(2u/μl)，水18μl，离心数秒，按下列参数进行PCR扩增循环30轮：变性94℃2min，(变性94℃30s，复性56℃30s，延伸72℃80s)延伸72℃5min；C、选择性扩增：将预扩产物1∶20稀释，作为选扩模板。选择性扩增体系：在0.2ml离心管中，按下列方式加入体积(25μl体系)：预扩增稀释样品2μl，10×PCR buffer 2.5μl，dNTPS0.5μl(10mM)，EcoRI引物1μl(5ng/μl)，Mse I引物1μl(30ng/μl)，Taq酶0.5μl(2u/μl)，H2O 17.5μl，以上混匀，离心数秒，按下列参数PCR循环：1轮扩增参数：94℃30s，65℃30s，72℃80s，以后每轮循环温度递减0.7℃，扩增12轮，接着按下列参数扩增23轮94℃30s，55℃30s，72℃80s；(4)AFLP图谱分析及标准的DNA指纹图谱的构建A、电泳大约1小时，测序仪激光管开始收集条带，胶图由测序仪软件自动生成。B、GENESCAN软件分析：用GENESCAN软件打开胶图，对胶图进行数据提取，安装胶图的MATRIX，选择合适的内标即SIZE STANDARD并设置软件合适的分析参数，分析得到结果；C、通过Binthere软件提取样品的各片段大小的结果，打开Binthere软件，导入数据，选择相应的荧光标记的颜色并选择合适的内标即SIZI STANDARD，点击分析，导出结果并将结果保存为XLS格式；D、EXCEL转换将表内的数值不为0转换为1，数值为0的不转换，从而生成由“0”和“1”组成的原始矩阵；E、EXCEL转换生成的0，1矩阵图，构建标准的青菜DNA指纹图谱；(5)青菜品种的鉴定将待测青菜样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。