[发明专利]一种用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。

背景技术

传统的青菜品种鉴定方法主要是对植株形态进行观察，但由于大部分青菜品种苗期相似，要到成株才开始表现品种的特性，所以从植株形态对青菜品种进行鉴定往往需要几个月的时间。

AFLP技术是一项分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，它是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。近年来，随着该技术的逐渐成熟，在品种鉴定及辅助育种上得到了具体的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用AFLP指纹技术鉴定青菜品种的方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

(1)基因池DNA的来源

从不同青菜品种的叶片提取DNA，混合成品种的基因池。提取及纯化方法采用CTAB法，其过程为：取0.1g青菜叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μl CTAB提取液后转入1.5ml离心管中；然后65℃水浴30min，其间震荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各提取一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清夜加入2倍的预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入双蒸水溶解DNA，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用。

(2)AFLP接头和预扩增、选扩增引物序列设计

接头的碱基序列：

EcoR I接头        5′＞CTCGTAGACTGCGTACC

                            CTGACGCATGGTTAA＜5′

Mse I接头        5′＞GACGATGAGTCCTGAG

                          TACTCAGGACTCAT＜5′

预扩增引物

EcoR I预扩引物序列：5’＞GAC TGC GTA CCA ATT CA＜3’

Mse I预扩引物序列：5’＞GAT GAG TCC TGA GTA AC＜3’

选扩增引物

Mse I扩增引物用FAM标记

Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA C/MseI-3：GAT GAG TCC TGA GTA ACA G

Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-2：GAT GAG TCC TGA GTA ACA C

Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-6：GAT GAG TCC TGA GTA ACT C

Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAA G/MseI-8：GAT GAG TCC TGA GTA ACT T

Primer E GAC TGC GTA CCA ATT CAC A/MseI-5：GAT GAG TCC TGA GTA ACT A

(3)AFLP反应条件

A、酶切和连接 限制性酶切及连接(20ul反应体系)，在0.5ml离心管中加入对照模板DNA4μl(50ng/μl)，Adapter 1μl(Mse I接头50pmoles/μL，EcoR I接头5pmoles/μL)，EcoRI/MseI 2μl(4u/μl每种)，10×Reaction buffer 2.5μl，10mM ATP 2.5μl，T4 Ligase 1μl(3u/μl)，AFLP-Water 7μl，混匀离心数秒，37℃保温5h，8℃保温4h，4℃10h；