[发明专利]改进高盐法提取线粒体DNA的方法及其应用

摘要

一种在高盐法的基础上改进的高盐法提取基因组和线粒体DNA的方法及其应用。本改进高盐法提取线粒体DNA的方法中使用包含异硫氰酸胍、盐酸胍等的蛋白变性剂进行细胞裂解，不仅具有沉淀蛋白质的作用，还具有抑制核酸酶的作用，可以大大提高DNA的纯度和产量。结合吸附柱使用后更为快速，简捷，单个样品操作一般可在20分钟内完成，多次柱漂洗确保高纯度，可直接用于PCR、Southern－blot和各种酶切反应。该方法操作简便、成本低，尤其适用于从临床标本中(特别是外周血中)快速提取基因组和线粒体DNA。

主权项

1.一种改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)细胞清洗：取100～300μl的分离好的细胞或组织匀浆液，加入20～900μl细胞清洗液，所述细胞清洗液为pH7.4的PBS缓冲液或生理盐水，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000～10000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物A；(2)细胞裂解：向所述沉淀物A中加入约300μl的含有浓度为1～10mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液，温和振荡或反复用移液器吸打沉淀物A 4～6次，在8000～10000rpm转速下离心约30秒，取上清液B，弃沉淀物；(3)乙醇或异丙醇沉淀：向所述上清液B中加入1/10其体积的浓度为3mol/L的pH5.2的NaAc溶液和2倍于其体积的乙醇或只加入等体积的异丙醇，充分混匀，得混合物C；(4)将所述混合物C在12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，再用75％乙醇重悬沉淀，12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，室温放置5～10分钟后，加入约25μl TE缓冲液，所述TE缓冲液为pH7.2的0.01M Tris.HCl和0.01M EDTA，混匀，50℃保温5～10分钟，在12000～14000rpm转速下离心约1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。