[发明专利]改进高盐法提取线粒体DNA的方法及其应用

权利要求书

1.一种改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)细胞清洗：取100～300μl的分离好的细胞或组织匀浆液，加入20～900μl细胞清洗液，所述细胞清洗液为pH7.4的PBS缓冲液或生理盐水，温和条件下混匀，室温或冰浴约10分钟，在8000～10000rpm转速下离心20～30秒，弃上清，重复上述步骤一或两次后，得沉淀物A；

(2)细胞裂解：向所述沉淀物A中加入约300μl的含有浓度为1～10mol/L的异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液，温和振荡或反复用移液器吸打沉淀物A 4～6次，在8000～10000rpm转速下离心约30秒，取上清液B，弃沉淀物；

(3)乙醇或异丙醇沉淀：向所述上清液B中加入1/10其体积的浓度为3mol/L的pH5.2的NaAc溶液和2倍于其体积的乙醇或只加入等体积的异丙醇，充分混匀，得混合物C；

(4)将所述混合物C在12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，再用75％乙醇重悬沉淀，12000～14000rpm转速下离心5分钟，弃上清，室温放置5～10分钟后，加入约25μl TE缓冲液，所述TE缓冲液为pH7.2的0.01M Tris.HCl和0.01M EDTA，混匀，50℃保温5～10分钟，在12000～14000rpm转速下离心约1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。

2.根据权利要求1所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的细胞裂解液的基础成分为0.5％的NP-40裂解液，其包括50mM Tris.HCl、15mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40和1mM PMSF，pH 6.8，用时配制好后再加入异硫氰酸胍或盐酸胍，使其浓度为1～10mol/L。

3.根据权利要求2所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)之间还包括步骤：加入约20μl的20mg/ml的蛋白酶K溶液。

4.根据权利要求3所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(2)中在加入含有异硫氰酸胍或盐酸胍的细胞裂解液反复振荡后再向沉淀物A中加入10～20μl的25mg/ml的RNA酶A，室温放置约10分钟，再加入约800μl浓度为4mol/L的NaClO₄溶液，调节PH5.2，加入约20μl树脂，混匀，室温放置约5分钟后再离心取上清液B。

5.根据权利要求1所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述步骤(4)为以下步骤所替代：将所述混合物C全部加入一个离心管式吸附柱中，所述吸附柱放入收集管中，在13000rpm转速下离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，加入约500μl抑制物去除液，所述抑制物去除液为50％异丙醇水溶液，在12000rpm转速下离心30秒，弃废液，再加入约700μl漂洗液，所述漂洗液为75％无水乙醇和3M NaAc的混合溶液，在12000rpm转速下离心30秒，弃掉废液，再加入500μl漂洗液，在12000rpm转速下离心30秒，弃掉废液，然后将吸附柱放至原先的收集管中，在13000rpm转速下离心2分钟，尽量除去漂洗液，取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附柱的吸附膜的中间部位加50μl已在65～70℃水浴中预热的洗脱缓冲液TE，室温放置3～5分钟，在12000rpm转速下离心1分钟，将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，在12000rpm转速下离心1分钟，吸取上清，即得到所提取的线粒体DNA。

6.根据权利要求5所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法，其特征在于：所述吸附柱的芯材料包括尼龙膜、硅胶膜或硝酸纤维素膜。

7.一种在权利要求1-6中任一项所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法中使用的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1-6任一项所述的方法中使用的全部试剂，且按照使用的顺序排列。

8.权利要求1-6任一项所述的改进高盐法提取线粒体DNA的方法在临床标本中快速提取线粒体DNA的应用。

9.权利要求7所述的试剂盒在临床标本中快速提取线粒体DNA的应用。