[发明专利]一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法

摘要

一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，属于真菌发酵生物活性产品技术领域。本发明涉及采用云芝发酵，将云芝接入以马铃薯为主要成分的培养基中，用HCl调节pH，发酵培养，收集菌体，反复冻融与超声波相结合将菌体细胞破碎，高速离心，离心上清液经过大孔树脂脱色得到粗抑制剂，再通过DEAE52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉。本发明所制备的抑制剂专一性抑制天冬氨酸蛋白酶的活性，粗抑制剂中含有的各种云芝发酵产物具有很高的医药保健价值，而且经过脱色处理，应用中不会产生色素方面的影响，保证安全性，在医药、食品添加剂及病虫害防治等领域有很好的应用前景。

主权项

1、一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征为：采用云芝发酵，将云芝接入以马铃薯为主要成分的培养基中，用HCl调节pH，发酵培养，收集菌体，反复冻融与超声波相结合将菌体细胞破碎，高速离心，离心上清液经过大孔树脂脱色得到粗抑制剂，再通过DEAE52离子交换层析得纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，再经真空冷冻干燥得天冬氨酸蛋白酶抑制剂干粉；其工艺为：A云芝发酵：(1)出发菌株：采用云芝(copious versicolor)作为出发菌株，该菌株购自华中农业大学菌种实验中心；(2)种子培养基(W/V)：切丝加热煮沸30min的新鲜马铃薯20％，葡萄糖2％，KH2PO4 0.3％，MgSO4·7H2O 0.15％，(NH4)2SO4 0.2％，麸皮1％，pH自然，121℃灭菌30min；培养条件：接入2～3粒黄豆粒大小的斜面菌块，26℃、150r/min培养4～6天；(3)发酵培养基组成(W/V)：糖2％，(NH4)2SO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.15％，Na2SO3 0.05％，KH2PO4 0.3％，马铃薯汁40％，121℃灭菌20min；发酵条件：发酵温度为24～28℃，发酵时间5天，搅拌频率为150～170r/min，起始pH为5.8～6.5，装液量为75mL/250mL三角瓶，接种量为10％；B提取并分离纯化天冬氨酸蛋白酶抑制剂：(1)反复冻融：将发酵液放入-20℃冰箱冷冻，取出后30℃水浴解冻，如此反复进行3次；(2)超声波破壁：超声波功率280W、温度20℃、处理量40mL进行细胞破碎10min，12000r/mim离心15min，收集上清细胞破碎液；(3)大孔树脂脱色：利用大孔树脂D101对上清细胞破碎液进行脱色；(4)离子交换层析：DEAE52离子交换纤维素色谱柱规格为15cm×2.2cm，平衡缓冲液为20mmol/L、pH7.0的磷酸钠缓冲液，洗脱模式：以平衡缓冲液洗脱2倍柱体积后，再以添加0.1mol/L NaCl的磷酸钠缓冲液进行洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，280nm波长紫外检测；(5)干燥成粉：采用真空冷冻干燥机将DEAE52离子交换层析0.1mol/LNaCl的磷酸钠缓冲液梯度下收集的峰液脱盐后干燥成粉，即为纯化的天冬氨酸蛋白酶抑制剂冻干粉。