[发明专利]一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法

说明书

技术领域

一种天冬氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，具体地说是利用云芝发酵，反复冻融结合超声波进行细胞破碎，通过大孔树脂脱色，DEAE离子交换层析，获得较纯的天冬氨酸蛋白酶抑制剂，属于真菌发酵生物活性产品技术领域。

背景技术

在中国，随着“纯生热”的不断升温，纯生啤酒的泡沫稳定性问题越来越受到生产厂家和研究者的关注。现有的研究证明，有活性的蛋白酶A及非活性的蛋白酶A前驱物的存在会直接或间接地破坏纯生啤酒的泡沫蛋白，从而使纯生啤酒的泡沫稳定性降低，蛋白酶A及其前驱物的总量决定着降解成品啤酒中泡沫蛋白的综合能力。

蛋白酶A的释放途径：PrA和其他蛋白酶在发酵和成熟阶段从酵母细胞中释放出来，酵母中蛋白酶A的释放主要是破坏泡持性蛋白质Z，而对纯生啤酒的泡持性产生不良的影响。降低啤酒中蛋白酶A的途径：第一种途径是限制酶的产生和分泌。第二种途径是控制或降低已经从酵母分泌的蛋白酶活性，这可以添加蛋白酶A抑制剂或使蛋白酶A失活来实现。第三种途径是通过基因工程技术构建蛋白酶A缺失的啤酒酵母菌株。国外国内对前期菌种和工艺方面都有一定的研究，但尚不能完全解决此问题，尤其是菌株方面，由于存在安全性问题以及公众对基因技术的态度问题，尚需细致而深入的研究。而寻找特异的PrA抑制剂，作为一种后修饰的思路，正在引起人们的关注。但是直到目前为止，还没有商业化的既安全又有效的蛋白酶A抑制剂可以在啤酒行业中使用。

蛋白酶A是一种天冬氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶，参与机体的新陈代谢及生物调控作用。它的活性中心由两个催化性天冬氨酸残基组成。天冬氨酸蛋白酶包括：胃蛋白酶、HIV蛋白酶抑制剂、蛋白酶A、组织蛋白酶D、逆转录蛋白酶、血管紧张素转化酶、天冬氨酸膜内裂解蛋白酶等。深入了解天冬氨酸蛋白酶及其特异的抑制剂，对治疗一些疾病如艾滋病、恶性肿瘤等世界上几种难治的疾病都有一定的帮助，天冬氨酸蛋白酶在这些疾病的发病机制中都发挥了一定的作用，积极了解天冬氨酸蛋白酶的活化机制、作用位点特别是其抑制特性，将会有助于治疗这些顽固性疾病。

蛋白酶抑制剂泛指对蛋白酶有抑制作用的一类物质，参与生物体内蛋白酶解活动的控制，对维持正常的生命活动具有重要意义。它的来源十分广泛，在各种动植物的组织器官中都有存在。按其所抑制的目标蛋白酶活性中心的不同，可分为以下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)：如胰蛋白酶抑制剂；半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cys-C)：如木瓜蛋白酶抑制剂；天冬氨酸蛋白酶抑制剂：如HIV蛋白酶抑制剂、胃蛋白酶抑制剂、蛋白酶A抑制剂和血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂；及金属蛋白酶抑制剂等。目前国内外报道的蛋白酶A抑制剂大多数都是通过化学法合成的，这些抑制剂在应用中受到相当大的限制；国外曾有人从马铃薯、番茄及豆科植物中提取出天冬氨酸族蛋白酶抑制剂；本实验室曾从灵芝发酵全粉中提到GLPIA1和GLPIA2两种蛋白酶A抑制剂，并从马铃薯块茎中提取一种蛋白酶A抑制剂。这些蛋白酶抑制剂在医药及食品添加剂等方面都有很好的应用前景。

云芝是我国传统的名贵药材，富含丰富的营养及多种生物活性成分，具有药用保健作用，是一种具有广泛药理活性的药用真菌。云芝液体深层发酵的发酵产物复杂，主要为云芝多糖和云芝糖肽。

云芝多糖是良好的生物效应调节剂，具有抑制肿瘤、调节免疫、降低放射、化疗毒副反应等多种药理作用，并有抗艾滋病毒活性，能调节人体的免疫功能，增强巨噬细胞的吞噬作用；因射线等引起免疫功能低下者，云芝多糖能显著提高其溶菌力；云芝多糖最重要的作用是它对肝脏的保护；云芝多糖对冠心病具有一定的治疗作用、抗动脉粥样硬化、提高鼠大脑皮层、肝组织的抗氧化作用，对顿抑心肌的功能和超微结构有显著保护作用，对慢性应激引起的学习和记忆障碍有明显的改善作用。

云芝糖肽是一种有效的免疫增强剂，抗肿瘤、镇痛、免疫调节、抗缺氧、促进多种细胞因子、抗乙肝病毒的产生；云芝或云芝糖肽与螺旋霉素合用，具有潜在的抗弓形虫感染的效果。

利用云芝发酵制备天冬氨酸蛋白酶抑制剂，除了对天冬氨酸蛋白酶具有抑制作用外，还有云芝多糖和云芝糖肽等的活性功能，保证了其应用的安全性，在医药保健及食品饮料等方面将有很好的应用前景。

发明内容