[发明专利]庆大霉素B的生产工艺

摘要

本发明公开了一种庆大霉素B的生产工艺，通过对小诺霉素的产生菌(棘孢小单孢菌)进行选育，采用细胞原生质体融合技术，选出一个庆大霉素B为主要组份的新菌株。本发明公开的庆大霉素B的生产工艺的优点在于：缩短了整个生产周期；提高了庆大霉素B的纯度，生产出的庆大霉素B的纯度由原来的85％提高到现在的90％。降低了生产成本，极大地提高了庆大霉素B的生产能力。

主权项

1. 一种庆大霉素B的生产工艺，其特征在于：包括以下步骤：1、1原生质体的制备：将活化好的小诺霉素菌种201-9#和201-65#接种在菌丝生长培养基中，201-9#和201-65#由小诺霉素菌种经自然选育而得，其重量配比为：麸皮1.5-2％，可溶性淀粉(C.P)1.0％，MgSO4(C.P)0.05％，KNO3(C.P)0.1，天冬素0.002％，K2HPO4(C.P)0.03％，NaCl(C.P)0.05％，CaCO3(C.P)0.1％，琼脂2.0％，pH调至7.5，蒸馏水配制；培养基制备：用不锈钢锅装好要配体积的蒸馏水，留出一部分拌料用，先将麸皮煮开，再把称好的琼脂放入锅内溶解；把原料按上述比例称好，放入小烧杯内，CaCO3单独后放，用留下的一部分水把原料溶解到入锅内，边倒边搅拌；用6N的NaOH调pH至7.5后，加入CaCO3搅拌均匀后分装；装量50ml-60ml/250ml茄子瓶或20ml/28×200mm大试管，加棉塞，包好后消毒；消毒后，冷却，即可摆斜面，待凝固后，于35-37℃恒温箱过夜后备用接种；斜面制备：用无菌接种棒取砂土孢子，用划线法接种于已消毒制备好的斜面培养基中，涂匀后，塞好棉塞，用纱布牛皮纸包瓶口后，于37℃培养10天，取出放入冰箱4-5℃下保存备用；摇瓶配比为：淀粉1％，黄豆饼粉1.0％，葡萄糖(C.P)0.1％，CaCO30.5％，蛋白胨0.2％，KNO3(C.P)0.05％，氯化钴10γ/ml，玉米粉1.5％，过滤水配制，pH7.7将上述培养基配制好后，装入500ml三角瓶中，装量50ml左右/瓶，在1.05kg/cm2121℃下灭菌30分钟，冷却备用；在无菌室超静工作台内用无菌接种针挖取斜面孢子约0.5cm2于三角瓶中，在旋转式240-250转/分摇瓶机上35℃±0.5℃培养130～144小时，放瓶，测效价、组分；其中菌种201-9#小诺霉素组分50％，摇瓶效价1085μ/ml，201-65#小诺霉素组分55％，摇瓶效价1130μ/ml；培养基的配方按重量百分比为淀粉3.5％-4％，黄豆饼粉3.0％-3.5％，葡萄糖0.3％-0.5％，玉米粉1.5％-2.0％，蛋白胨0.15％-0.2％，鱼粉0.2％-0.4％，硫酸铵0.01％-0.05％，硝酸钾0.005％-0.01％，碳酸钙0.4％-0.5％，氯化钴8mg/ml-10mg/ml，其PH7.5-7.8；振荡培养60～65小时，离心收集菌体，用10％-12％蔗糖溶液洗涤后，加浓度14mg/ml-16mg/ml溶菌酶37℃±0.5℃下水浴酶解，镜检至大量原生质体形成；1、2融合：将201-9#和201-65#原生质体悬液按等量混合，再加入聚乙二醇，25℃±1℃室温下振摇1-2分钟，再放置1.5～2小时，取0.1-0.2ml/皿涂布在再生平皿，35℃±1℃倒置培养至长出菌落，其中一菌落为红色，对该菌株进行组份和摇瓶效价测定，该菌株含有庆大霉素B组份，再对这一菌株进行自然选育，获得庆大霉素B含量高的优质菌株，并做稳定性实验，传5代证明其稳定性良好，将此菌株命为JYGB-01；1、3庆大霉素B的制备：37℃±0.5℃下庆大霉素B沙土孢子培养10天得母斜F1，再在37℃±0.5℃下进行孢子培养9天得子斜F2，在35℃±1℃左右一级种子罐培养50hr，得一级种子培养液，34℃±1℃二级种子罐培养24hr得二级种子培养液，34℃±1℃下发酵80～85hr，发酵液中加入6N浓度H2SO4调整pH至2.0左右，在酸化液中再加入2NNaOH中和至pH6.8左右，得中和液，用732NH4 +(Na+)型树脂搅拌下静态吸附5～6hr进行离子交换，饱和树脂离心分离以除去异物，对饱和树脂装柱7％HCl及NH4Cl、去离子水洗至无Cl-，再用0.5N氨水解吸后解吸液711-OH-型脱色，对脱色液薄膜浓缩，所得浓缩液，继续用活性碳脱色过滤，吸附型大孔树脂分离、浓缩，采用溶媒剃度解析，先后得到GMB、GMC1a 和GMC2b，精制后即可得到组份含量≥90％，可供合成异帕米星用。