[发明专利]庆大霉素B的生产工艺

说明书

技术领域

本发明涉及一种庆大霉素B的产生菌，本发明涉及一种庆大霉素B的生产工艺。

背景技术

在美国专利：No.3091572 1975.10.28中所述的庆大霉素B是从抗生素副产物中分离出来，通过绛红色小单孢菌和棘刺小单孢菌发酵得到了的整个抗生素混合物。采取一种柱层析分离方法，即采取一个溶剂系统的下层，该溶剂系统由甲醇、氯仿、氢氧化铵组成，作为洗提溶剂，进行分离。在色谱法之前，等体积的这些溶剂进行混合并放置，使层分离出。庆大霉素C(由3种组份构成，C₁、C_1a和C₂)是首先洗提出来，然后依次为庆大霉素B₁、庆大霉素X、庆大霉素B，最后为庆大霉素A。从专利中可以看出庆大霉素B是作为庆大霉素的副产物(小组份)之一被提取出来，因组份多，含量低，所以分离难度大，纯度低，成本高。

发明内容

本发明的目的在于：对小诺霉素的产生菌(棘孢小单孢菌)进行选育，采用细胞原生质体融合技术，选出一个庆大霉素B为主要组份的新菌株，并提供其生产工艺。

本发明通过以下方案实现：将活化好的小诺霉素菌种201-9^#和201-65^#接种在菌丝生长培养基中，201-9^#和201-65^#由小诺霉素菌种经自然选育而得，其重量配比为：麸皮1.5-2％，可溶性淀粉(C.P)1.0％，MgSO₄(C.P)0.05％，KNO₃(C.P)0.1，天冬素0.002％，K₂HPO₄(C.P)0.03％，NaCl(C.P)0.05％，CaCO₃(C.P)0.1％，琼脂2.0％，pH调至7.5，蒸馏水配制；培养基制备：用不锈钢锅装好要配体积的蒸馏水，留出一部分拌料用，先将麸皮煮开，再把称好的琼脂放入锅内溶解；把原料按上述比例称好，放入小烧杯内，CaCO₃单独后放，用留下的一部分水把原料溶解到入锅内，边倒边搅拌；用6N的NaOH调pH至7.5后，加入CaCO₃搅拌均匀后分装；装量50ml-60ml/250ml茄子瓶(或20ml/28×200mm大试管)，加棉塞，包好后用1kg/cm² 120℃30分钟消毒(压力要求稳定)。消毒结束后，稍冷几分钟，即可摆斜面，待凝固后，于35-37℃恒温箱过夜后备用接种；斜面制备：用无菌接种棒取一定量的砂土孢子，用划线法接种于已消毒制备好的斜面培养基中，涂匀后，塞好棉塞，用纱布牛皮纸包瓶口后，于37℃培养10天，取出放入冰箱(4-5℃)保存备用；摇瓶配比为：淀粉1％，黄豆饼粉1.0％，葡萄糖(C.P)0.1％，CaCO₃0.5％，蛋白胨0.2％，KNO₃(C.P)0.05％，氯化钴10γ/ml，玉米粉1.5％，过滤水配制，pH7.7将上述培养基配制好后，装入500ml三角瓶中，装量50ml左右/瓶，在1.05kg/cm²121℃下灭菌30分钟，冷却备用；在无菌室超静工作台(100级)内用无菌接种针挖取斜面孢子约0.5cm²于三角瓶中，在摇瓶机上(旋转式240-250转/分)35℃±0.5℃培养130～144小时，放瓶，测效价、组分。其中菌种201-9^#小诺霉素组分50％，摇瓶效价1085μ/ml，201-65^#小诺霉素组分55％，摇瓶效价1130μ/ml.)培养基的配方按重量百分比为淀粉3.5％-4％，黄豆饼粉3.0％-3.5％，葡萄糖0.3％-0.5％，玉米粉1.5％-2.0％，蛋白胨0.15％-O.2％，鱼粉0.2％-0.4％，硫酸铵0.01％-0.05％，硝酸钾0.005％-0.01％，碳酸钙0.4％-0.5％，氯化钴8mg/ml-10mg/ml，其PH7.5-7.8；振荡培养60～65小时，离心收集菌体，用10％-12％蔗糖溶液洗涤后，加浓度14mg/ml-16mg/ml溶菌酶37℃±0.5℃下水浴酶解，镜检至大量原生质体形成；